本发明专利技术涉及一种仲丁醇耐受菌株，名称为S-2，分类名称为Lysinibacillus?fusiformis，保藏编号为：CGMCC?No.?6769，保藏日期：2012年11月2日，保藏地址为：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明专利技术仲丁醇耐受菌株耐受仲丁醇能力强，可以应用于通过代谢工程和基因工程来构建产仲丁醇工程菌株，进而通过微生物发酵法来生产仲丁醇，弥补了目前仍未发现在细菌中存在仲丁醇合成的基因和生物化学方面的证据，以及在自然界的微生物中并没有发现仲丁醇的合成途径的缺陷；同时，由于该仲丁醇耐受菌株具有较强的仲丁醇降解能力，因此，也可应用于仲丁醇污染的生物修复。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物
，涉及仲丁醇耐受菌株，尤其是一种仲丁醇耐受菌株及其筛选方法和应用。
技术介绍
仲丁醇有很多用途，可以作为工业溶剂、乳化剂、染料、分散剂、脱水剂、脱漆剂和工业洗涤剂。另外，仲丁醇也可作为提高汽油辛烷值的组分、增塑剂、选矿剂和除草剂。工业上大规模生产仲丁醇主要依靠I- 丁烯和2- 丁烯的水合法来生产。目前仲丁醇的产量达到90万吨/年，而生产厂家主要集中于欧洲和美国。仲丁醇不能直接用发酵法来生产，生产方法主要是化学法首先，碳源经过一系列 的代谢途径转化为2，3-丁二醇；其次，2，3-丁二醇在酶的作用下脱水生成甲乙酮(MEK);最后，甲乙酮通过氢化反应转化为仲丁醇。据报道，一些乳酸杆菌能够利用2，3-丁二醇生产仲丁醇。然而，目前仍未发现在细菌中存在仲丁醇合成的基因和生物化学方面的证据，在自然界的微生物中并没有发现仲丁醇的合成途径。通过检索，并未发现与本专利申请相关的专利公开文献。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种具有较高的仲丁醇耐受能力及较强的仲丁醇降解能力的仲丁醇耐受菌株，该菌株可应用于构建产仲丁醇工程菌株和仲丁醇污染的生物修复；也提供了一种从自然界中富集和分离耐受和降解仲丁醇菌株的筛选方法。本专利技术实现目的的技术方案如下一种仲丁醇耐受菌株，名称为S-2,分类名称为Lysinibacillus fusiformis,保藏编号为=CGMCC No. 6769，保藏日期2012年11月2日，保藏地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。如上所述的仲丁醇耐受菌株在构建产仲丁醇工程菌株中的应用。如上所述的仲丁醇耐受菌株在仲丁醇污染的生物修复中的应用。如上所述的仲丁醇耐受菌株的筛选方法，从不同环境样品中，通过含有不同浓度仲丁醇的富集培养基及耐受培养基进行筛选，并使用菌株的相对生长率作为指标筛选仲丁醇耐受菌株。而且，所述仲丁醇耐受菌株的筛选方法，具体步骤如下⑴从不同生态环境中采集样品得不同环境样品；⑵仲丁醇耐受菌株的富集与分离将不同环境样品混合后使用生理盐水充分溶解，取上清液置于含有仲丁醇的富集培养基中在摇床上恒温培养后，吸取部分上清液重新置于新鲜的富集培养基中，如此重复三代；取富集后的菌悬液涂布在含有仲丁醇的固体富集培养基上培养，分离单菌落，得分离菌株；⑶筛选菌株的耐受性分析将分离菌株分别接种到含有仲丁醇的耐受培养基中，以不含仲丁醇的作为对照，培养24 h，用分光光度计在600 nm波长下测每株菌的菌体密度，并计算菌体的相对生长率，相对生长率达到0.29 g/(L*h)以上的菌株即为仲丁醇耐受菌株。 而且，所述不同环境样品为山东或河北或天津地区的土壤、污泥、沼气池、臭水沟或海水。而且，所述富集培养基为=KH2PO40. 5 g/L，K2HPO4 0. 5 g/L，FeSO4 7H20 0. 01 g/L，MgSO4 0.2 g/L, NaCl 9g/L，酵母粉 5 g/L，葡萄糖 30 g/L，仲丁醇 5 g/L, pH 7.0，IX IO5Pa、115 °C，灭菌 20 min ；所述耐受培养基为NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，质量浓度分别为0.5% 或 1% 或 I. 5% 的仲丁醇，pH 7. 0,1 X IO5 Pa、121 ° C，灭菌 20 min。而且，还包括对筛选所得仲丁醇耐受菌株进行降解性分析。而且，所述对筛选所得仲丁醇耐受菌株进行降解性分析的步骤如下将分离的菌株分别接种到含有不同浓度仲丁醇的LB培养基和基本培养基上，对照组为接入与菌体量相等的生理盐水，培养24小时后，检测发酵液及对照组的仲丁醇剩余量，计算得菌株对仲丁醇的降解率。而且，还包括对筛选所得仲丁醇耐受菌株进行菌种鉴定，步骤如下⑴DNA提取方法苯酚-氯仿-异戊醇法抽提；(2) 16S rRNA 引物正向引物=SEQ NO. 1，反向引物=SEQ NO. 2 ；(3) PCR 反应体系10 X Reaction Buffer 5. 0 U L,NTP 2. 5 mmol/L 4. 0 U L,正向引物10 uMol/L I. 0 U L,反向引物10 uMol/L I. Ou L,aq 聚合酶 5 U/ ii L 0.8 U L,DMSO I u L,模版DNA 50 ng/ U L 2. 0 U L,补加重蒸水至50 u L ；(4)卩0 扩增程序94°0 5 min ；94°C 40s ；51°C 2 min ；72°C 3 min 30 个循环;72°C 15 min ；4°C 2 h ；(5)数据处理凝胶纯化PCR，使用NCBI Blast分析分离菌株的同源性，并使用Ribosomal Database Project II 软件 Classifier,对分离的菌株进行分类。本专利技术取得的优点和有益效果是I、本专利技术仲丁醇耐受菌株耐受仲丁醇能力强，在仲丁醇为15 g/L的情况下仍然生长良好，与没有加仲丁醇的菌相比，其相对生长率分别为0. 58 g/(L -h)，因此可以应用于通过代谢工程和基因工程来构建产仲丁醇工程菌株，进而通过微生物发酵法来生产仲丁醇，弥补了目前仍未发现在细菌中存在仲丁醇合成的基因和生物化学方面的证据，在自然界的微生物中并没有发现仲丁醇的合成途径的缺陷；同时，由于该仲丁醇耐受菌株具有较强的仲丁醇降解能力，因此，也可应用于仲丁醇污染的生物修复。2、本专利技术仲丁醇耐受菌株的筛选方法主要利用在富集培养基和选择性培养基上来富集和分离菌株，通过16S rRNA鉴定菌株，并且通过计算相对生长率和降解率以及分析降解仲丁醇的酶活力来检测筛选菌对仲丁醇的耐受和降解能力，工艺相对简单，筛选菌株准确，为微生物发酵法生产仲丁醇提供了新思路。附图说明图I为本专利技术筛选方法筛选出的30株耐受菌株的相对生长率图；其中，A :在0. 5%仲丁醇浓度下30株耐受菌株的相对生长率图；B :在I. 0%仲丁醇浓度下30株耐受菌株的相对生长率图；·C :在I. 5%仲丁醇浓度下30株耐受菌株的相对生长率图；图2为本专利技术30株分离菌株在不同培养基中对仲丁醇的降解率图；其中，A :在LB培养基中30株分离菌的降解率图；B :在基本培养基中30株分离菌的降解率图；图3为本专利技术部分分离菌株的全基因组电泳图；图4为本专利技术PCR方法扩增部分分离菌株16S rRNA基因片段电泳图；图5为本专利技术部分分尚菌株发育树的构建图。具体实施例方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。需要说明的是从不同地域的不同生态环境中分离得到的微生物，其耐受仲丁醇能力不同，采用相对生长率来分析筛选菌株对仲丁醇的耐受情况，从而筛选出耐受较强的微生物。另外，本专利技术也通过测筛选菌对仲丁醇的降解率来分析菌株对仲丁醇的降解能力。一种仲丁醇耐受菌株，名称为S-2,分类名称为Lysinibacillus fusiformis,保藏编号为=CGMCC No. 6769，保藏日期2012年11月2日，保藏地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种仲丁醇耐受菌株，其特征在于：名称为S?2，分类名称为Lysinibacillus?fusiformis，保藏编号为：CGMCC?No.?6769，保藏日期：?2012?年?11?月?2?日，保藏地址为：北京市朝阳区大屯路?中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
【技术特征摘要】
1.一种仲丁醇耐受菌株，其特征在于名称为S-2，分类名称为Lysinibacillusfusiformis，保藏编号为CGMCC No. 6769，保藏日期2012年11月2日，保藏地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。2.如权利要求I所述的仲丁醇耐受菌株在构建产仲丁醇工程菌株中的应用。3.如权利要求I所述的仲丁醇耐受菌株在仲丁醇污染的生物修复中的应用。4.一种如权利要求I所述的仲丁醇耐受菌株的筛选方法，其特征在于从不同环境样品中，通过含有不同浓度仲丁醇的富集培养基及耐受培养基进行筛选，并使用菌株的相对生长率作为指标筛选仲丁醇耐受菌株。5.根据权利要求4所述的仲丁醇耐受菌株的筛选方法，其特征在于具体步骤如下 ⑴从不同生态环境中采集样品得不同环境样品； ⑵仲丁醇耐受菌株的富集与分离将不同环境样品混合后使用生理盐水充分溶解，取上清液置于含有仲丁醇的富集培养基中在摇床上恒温培养后，吸取部分上清液重新置于新鲜的富集培养基中，如此重复三代；取富集后的菌悬液涂布在含有仲丁醇的固体富集培养基上培养，分离单菌落，得分离菌株； ⑶筛选菌株的耐受性分析将分离菌株分别接种到含有仲丁醇的耐受培养基中，以不含仲丁醇的作为对照，培养24 h，用分光光度计在600 nm波长下测每株菌的菌体密度，并计算菌体的相对生长率，相对生长率达到0.29 g/(L*h)以上的菌株即为仲丁醇耐受菌株。6.根据权利要求4或5所述的仲丁醇耐受菌株的筛选方法，其特征在于所述不同环境样品为山东或河北或天津地区的土壤、污泥、沼气池、臭水沟或海水。7.根据权利要求4或5所述的仲丁醇耐受菌株的筛选方法，其特征在于所述富集培养基为KH2PO4 0.5 g/L, K2HPO4 0.5 g/L，FeSO4 7H20 0. 01 g/L, MgSO4 0.2 g/L, NaCl 9g/L，酵母粉 5 g/L，葡萄糖 30 g/L，仲丁醇 5 g/L, pH 7.0，I ...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨洪江，石礼涛，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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