层析方法及为此使用的介质技术

本发明专利技术涉及在介质上进行离子交换层析的方法，所述介质包含具有多孔内芯和外壳的壳式珠粒，其中内芯提供有其电荷随pH改变的配位体，壳提供有带电荷的离子交换配位体，所述方法包括以下步骤：a)使样品分子在第一pH吸附在壳配位体上；b)通过加入缓冲剂物质使内芯配位体在第二pH放电，所述缓冲剂物质能够增加它与芯配位体相同符号/类型的电荷，这同时导致离子从内芯配位体释放，从而导致增加离子强度，增加离子强度从壳配位体置换样品分子，即，产生洗脱。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及新的离子交换介质及其用途。更准确地讲，本专利技术涉及在包含壳式珠粒(shell bead)的介质上进行离子交换层析的方法。介质包含在芯中其电荷随pH改变的配位体和在外壳中能够结合样品分子的离子交换配位体。背景在生物技术内，最近提出的层析方法基于与靶相互作用的不同模式。因此，例如，在离子交换层析中，官能团为与它们的相反电荷可交换反离子的持久结合的离子基团。生物分子的离子交换层析一般使用的层析介质用在珠粒中均匀分布的适合带电配位体取代。为了达到用于洗脱被吸附生物分子的盐梯度和/或pH梯度，用具有不同洗脱剂的两个泵得到梯度。最初，非排代流动相泵输送大部分(如果不是全部)流量通过层析介质，而排代流动相泵将很少(或甚至没有)流量输送通过层析介质。然后，连续或间歇改变各泵的流速，以得到适合洗脱被吸附化合物的梯度。因此，在很多情况下，为了洗脱被吸附的样品分子，希望比使用常规双泵装配用来产生盐梯度和/或pH梯度更简单的进行离子交换层析的方法。专利技术概述本专利技术提供进行离子交换层析的新原理，所述原理不依赖双泵装配来产生盐梯度和/或pH梯度用于洗脱被吸附的样品分子。第一方面，本专利技术提供在介质上进行离子交换层析的方法，所述介质包含具有多孔内芯和外壳的壳式珠粒，其中内芯提供有其电荷随pH改变的配位体，壳提供有带电荷的离子交换配位体，所述方法包括以下步骤：a)使样品分子在第一pH吸附在壳配位体上；b)通过加入缓冲剂物质使内芯配位体在第二pH放电，所述缓冲剂物质能够增加它与芯配位体相同符号/类型的电荷，这同时导致离子从内芯配位体释放，从而导致增加离子强度，增加离子强度从壳配位体置换样品分子，即，产生洗脱。可使用任何类型的缓冲剂物质，例如，胺缓冲剂，只要它与芯配位体(例如，胺配位体)为相同类型(具有相同类型的电荷)。根据以下公式，在pH增加时，这引起增加的离子强度： M=珠粒基质。优选外壳配位体为强离子交换配位体，例如-+N(CH3)3和所有类型的季铵配位体，非芳族和芳族-SO3–配位体。在优选的实施方案中，官能化芯的电荷改变/pH单位为>30μmol/pHmL凝胶。根据本专利技术的方法，壳配位体和芯配位体可具有相同或不同的电荷，并且选自任何类型的阳离子配位体，例如羧酸根(-COO-)、膦酸根或磷酸根(分别为-PO32-、-P(OH)O2-和-OP(OH)O2-、-OPO32-)、磺酸根或硫酸根(分别为-SO3-和-OSO3-)、-芳基-O-(酚根/芳醇根(arylolate))；或任何类型的阴离子配位体，例如，带正电荷的不同的氮，例如，伯铵、仲铵、叔铵、季铵和脒鎓(amidinium)。根据前述主张中一项或多项的方法，其中芯的孔隙率防止或允许样品分子穿透进入芯。优选壳式珠粒具有3至400μm的直径，外壳为0.5-100μm厚。例如，在具有100μm直径的壳式珠粒的情况下，外壳为0.5-10μm。在具有300μm直径的壳式珠粒的情况下，外壳为0.5-30μm。在供选的实施方案中，在方法以柱形式进行时，流的方向在洗脱步骤中反向，即，将柱倒转。这使得能够有足够时间用于离子强度积累，并实现样品分子通过层析床的较短输送距离，从而得到尖峰。第二方面，本专利技术涉及用于以上方法的层析介质，所述介质包含具有多孔内芯和外壳的壳式珠粒，其中内芯提供有其电荷随pH改变的配位体，壳提供有带电荷的离子交换配位体。第三方面，本专利技术涉及以上层析介质用于生物和合成源的样品分子的离子交换层析的用途，所述样品分子例如细胞和/或其部分、病毒和/或其部分、蛋白、复合蛋白、融合蛋白、肽、核酸、两性大分子、两性颗粒、药物、药物片段。该用途可为柱、微量滴定(microtiter)或批形式。附图简述图1显示用于阳离子交换介质的珠粒设计，具有芯配位体，芯配位体的电荷和结合相关反离子的能力可由pH转变来改变。图2显示在用50%的原型HFA 55芯 PEI壳-S(弱阴离子配位体)和50% 的S-壳(强阳离子)原型填充的柱上的核糖核酸酶A的分离(细节参见实验部分)。专利技术详述本专利技术提出使用具有芯的“壳式珠粒”，芯用可质子化和可去质子化的官能团(弱离子交换配位体)官能化，芯可通过用(缓冲剂)化合物改变pH来减少电荷或放电，(缓冲剂)化合物继而在过程中增加芯的电荷，同时改变周围溶液(流动相)中的离子强度，并实现吸附到带电优选强离子交换配位体的蛋白的洗脱。目标为样品吸附的离子交换配位体优选连接到薄外壳，芯配位体为具有允许在对应用适合的pH范围中改变电荷的pKa的弱离子交换配位体，芯配位体可以为带有与壳配位体相同的电荷或相反的电荷两者。为了通过在短pH间隔中相对尖pH转变来改变电荷或者在宽pH间隔中缓慢地逐渐改变电荷，芯配位体可取决于它们所选择的化学结构。可用后者类型的配位体在层析柱上产生pH和盐梯度。与共同待决SE专利申请1050157-5的色谱聚焦介质比较，为了释放足够高量的盐离子，在本专利技术的芯中的配位体密度高数倍。为了避免结合样品取代基，可调节芯的孔隙率，以排除蛋白/肽。另外，流动相可使用“一般”缓冲物质的简单混合物，所述缓冲物质能够使芯配位体放电和同时获得具有相同符号的电荷，因此允许从芯配位体释放反离子。当然，只有一个泵(没有洗脱剂混合设备)是在珠粒中和周围得到增加的离子强度所必需的。此类型介质的主要应用领域是蛋白和肽的大规模精制。此类型珠粒也非常适用于分析应用。现在将结合附图和实验部分描述本专利技术。实验部分在本文中实施例只为了说明目的提出，不应解释为限制附加权利要求限定的专利技术。总论基质的体积是指澄清床体积，以克给出的基质的重量是指抽干重量(去除空隙水的溶胀珠粒)。为了反应，搅拌使用电动搅拌器。将常规方法用于分析官能性和确定烯丙基化度或珠粒上的胺含量度。以下说明制备本专利技术的分离基质的一种方法，从交联琼脂糖凝胶(Sepharose? HFA 55，GE Healthcare，Uppsala，Sweden)开始。Sepharose HFA 55的珠粒直径为约90μm。采用基于Sepharose HFA 55 - HFA 55芯-PEI壳-SO3-的内部pH和离子强度梯度洗脱的等度离子交换层析所用壳介质的制备Sepharose HFA 55的烯丙基活化在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤Sepharose HFA 55。将凝胶(800mL排水凝胶)加入3颈圆底烧瓶。加入NaOH(800mL，50%溶液)，并开始机械搅拌，将浆料在水浴上加热到50℃。在约1小时后，加入168mL烯丙基缩水甘油基醚(AGE)。然后使浆料在剧烈搅拌下过夜。在约20小时后，将浆料转移到玻璃过滤器，用蒸馏水(x5)、乙醇(x2)和蒸馏水(x5)洗涤。然后通过滴定(230μmol/mL)测定烯丙基含量。壳活化(部分溴化)将100mL烯丙基化凝胶称入烧瓶，并加入1000mL蒸馏水。使0.354mL溴溶于100mL蒸馏水，将此溶液加到烯丙基化凝胶浆料。该量的溴相当本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.07.09 SE 1050774-71. 一种在介质上进行离子交换层析的方法，所述介质包含具有多孔内芯和外壳的壳式珠粒，其中内芯提供有其电荷随pH改变的配位体，壳提供有带电荷的离子交换配位体，所述方法包括以下步骤：a)使样品分子在第一pH吸附在壳配位体上；b)通过加入缓冲剂物质使内芯配位体在第二pH放电，所述缓冲剂物质能够增加它与芯配位体相同符号/类型的电荷，这同时导致离子从内芯配位体释放，从而导致增加离子强度，增加离子强度从壳配位体置换样品分子，即，产生洗脱。
2. 权利要求1的方法，其中壳配位体为强离子交换配位体，例如-+N(CH3)3和所有类型的季铵配位体、非芳族和芳族-SO3–配位体。
3. 权利要求1至2的方法，其中官能化芯的电荷改变/pH单位为>30μmol/pHmL凝胶。
4. 前述权利要求中一项或多项的方法，其中壳配位体和芯配位体可具有相同或不同的电荷，并且选自任何类型的阳离子配位体，例如羧酸根(-COO-)、膦酸根或磷酸根(分别为-PO32-、-P(OH)O2-和-OP(OH)O2-、-OPO32-)、磺酸根或硫酸根(...

【专利技术属性】
技术研发人员：J贝格斯特伦，BL约翰逊，
申请(专利权)人：通用电气健康护理生物科学股份公司，
类型：
国别省市：