本发明专利技术公开了一种在基质为亲水改性聚丙烯酸酯类或其共聚物材料上制备亲和层析介质的方法及由此方法制得具有高通量层析性能的产品。制备方法包括：（1）用氧化剂在酸性条件下进行选择性氧化，将材料表面的羟基氧化为醛基；（2）通过氨基与醛基生成席夫碱的反应将亲和配基化学偶联于介质表面，制得亲和层析介质。由此方法得到的产品的特征在于产品基质为超大孔聚丙烯酸酯类材料，此基质的表面已经化学偶联了亲水性多糖分子，在此亲水性表面上进一步衍生得到了此种亲和介质产品。本发明专利技术提供的方法，操作简便、反应条件温和，得到的亲和层析介质稳定，通透性高，配基偶联量高，对抗体选择性高，在生物技术尤其是生化分离领域有很大的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
—种亲和层析介质、制备方法及其用途
本专利技术涉及聚合物层析介质制备及应用领域，尤其涉及一种以聚合物材料为基质的亲和层析介质的产品及其制备方法，以及产品在生化色谱分离方面的应用，特别指以超大孔聚丙烯酸酯类材料为基质的亲和介质产品的制备及其应用。
技术介绍
亲和层析是通过介质上的配基与目标分子之间的特异性吸附和解离来实现纯化目标分子的目的。由于这种特异性的作用力，亲和层析具有高度选择性、高活性回收等特点，对分离含量极少又不稳定的生物活性物质极为有效，成为生物制药领域中分离纯化生物活性物质的ー种重要方法。随着当前生物医药技术的快速发展，对疫苗、抗体类药物的需求与日俱增，因此，如何快速高效地得到纯度较高的疫苗、抗体分子是ー项一直追求的目标。目前商品化亲和层析介质多以琼脂糖为基质，由于其为多糖基质，质地较软、孔径小，故机械强度差，难以提高流速，因此成为实现快速、高效分离纯化的瓶颈。聚合物微球作为生化分离介质，其优点在于机械強度高、化学性质稳定、耐受pH范围宽，能够在高压下操作等。另外，为了改善微球表面性能，提高其亲水性，本申请的在先申请已经将微球表面化学镀层了ー层亲水性多糖分子(CN201210091582.X)，充分抑制了蛋白等生物大分子在介质表面的非特异性吸附，修饰后的微球仍能保持较好的通透性。迄今为止，未见报道在多糖亲水化PGMA-DVB超大孔微球表面，氧化成醛后偶联亲和配基的方法，以及该方法制备的高流速的亲和层析介质。
技术实现思路
本专利技术的目的之ー在于提供ー种能够满足快速、高效层析过程的亲和层析介质，所述层析介质克服了多糖基质孔径小、机械强度差和流速低的问题。为了达到上述目的，本专利技术采用了如下技术方案:ー种亲和层析介质，其以表面亲水化的超大孔聚丙烯酸酯类或其共聚物微球为基质，该基质具有孔径分布范围为200?500nm的孔道，且表面偶联有亲水性的多糖分子，含氨基的亲和配基通过醛基与基质进行偶联。所述超大孔意指孔径为200?500nm。本申请所述基质可由本 申请人:的在先申请CN102617869A公开的方法制备得到。该亲和层析介质偶联配基后，介质仍能保持良好的通透性。所述表面亲水化的具有超大孔结构的聚丙烯酸酯类或其共聚物微球具有大孔贯穿结构，适合大分子快速传质，可以有效提高分离速度。优选地，所述基质为表面亲水化的超大孔甲基丙烯酸缩水甘油醚与ニこ烯基苯共聚物微球(PGMA-DVB)。优选地，所述多糖选自琼脂糖、葡聚糖或蔗糖中的任意一种或者至少两种的混合物。本专利技术选择表面亲水化的超大孔聚丙烯酸酯类或其共聚物作为基质，优选表面亲水化的超大孔聚丙烯酸酯类或其共聚物微球，基质表面偶联了亲水性的多糖分子，在使微球表面具有亲水性的同时表面还具有大量的可进ー步衍生的羟基，本专利技术正是利用微球表面的羟基氧化成醛，然后利用醛基偶联大分子亲和配基，最后制得对抗体等生物大分子有特异选择性的亲和层析介质。与传统的多糖基质的亲和层析介质相比，该介质具有百纳米级的贯通孔，可以对大尺寸生物分子有很好的传质特性，偶联亲和配基后，可以实现快速、高效和高通量的亲和层析过程。该亲和层析介质为多孔结构，平均孔径覆盖范围为20?500nm，粒径范围15?200 u m,耐受压カ范围0?20MPa，表面化学偶联大分子亲和配基分子量范围10-10000kDa。所述基质表面能够偶联大尺寸分子亲和配基，所述亲和配基的分子量范围IO4?IO7Da,偶联配基后仍能保持高的通透性，操作流速可覆盖0?3200cm/h，耐受压力范围为0 ?20MPa。所述亲和层析介质能够在高流速下继续保持高载量,在流速10?1600cm/h流速范围内，结合目标物动态载量变化20%。所述亲和配基选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、Protein G、Protein A、こ肝表面抗原、破伤风疫苗或狂犬疫苗抗原中任意一种或者至少两种的组合。偶联亲和配基后的亲和层析介质主要针对各种抗体分子有特异性结合，用于纯化各类抗体及疫苗等生物大分子。本专利技术的目的之ニ在于提供ー种如上所述的亲和层析介质的制备方法，所述方法包括如下步骤:(I)选择性氧化:将表面亲水化的聚丙烯酸酯类或其共聚物微球表面的羟基选择性氧化为醛基，得到氧化后的微球；(2)偶联亲和配基:将亲和配基通过共价键化学键合到氧化后的微球表面。表面亲水化的聚丙烯酸酯类或其共聚物微球，包括表面亲水镀层琼脂糖、葡聚糖、蔗糖等糖类的亲水化微球。传统多糖基质的介质表面偶联蛋白大分子的方法多为环氧活化、溴化氰活化和戊ニ醛活化法等方法，本专利技术中所采用的氧化法将介质表面的羟基选择性氧化成醛，然后将带有氨基的亲和配基分子偶联至介质表面。作为优选技术方案，步骤(I)中所述选择性氧化过程如下:将表面亲水化的聚丙烯酸酯类或其共聚物微球置于酸性溶液中，然后加入氧化剂，控制反应温度为30?60°C，反应2?12h后，得到醛基密度可控的活化中间物即氧化后的微球。所述酸性溶液的pH 值为 2 ?5，例如 2.2,2.5,2.8,3.1,3.4,3.7,4,4.3,4.6 或4.9。作为优选技术方案，步骤(I)中所述酸性溶液的pH调节所用酸可以选择盐酸、硫酸或醋酸中的任意一种或者至少两种的混合物。所述氧化剂可以为高锰酸钾、高碘酸、高碘酸钾或次氯酸钠中的任意一种或者至少两种的混合物。优选地，所述氧化剂的浓度为10?30mg/mL酸性溶液，S卩，每ml酸性溶液中含有10?30mg的氧化剂,优选13?27mg/mL酸性溶液。所述酸性溶液的体积用量为被氧化的微球质量的10?20倍。即微球质量:溶剂体积(酸性溶液体积)=1:10?20 (g/mL)。所述反应温度例如为33で、36で、39で、42で、45 °C、48 °C、51で、54で、57 V或59°C，优选35?55 °C，进ー步优选38?52°C。所述反应时间例如为2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5h、8h、8.5h、9h、9.5h、10h、10.5h、llh 或 11.5h，优选 2 ?10h，进ー步优选 3 ?9h。作为优选技术方案，步骤(2)中偶联亲和配基的过程为:将步骤(I)得到的氧化后的微球放入反应釜中，加入含亲和配基的缓冲溶液，调节pH值3.0?8.0进行偶联反应，控制反应温度20?40°C，保持反应24?72h，得到表面偶联亲和配基的亲和层析介质。通过氨基与醛基生成席夫碱的反应将亲和配基化学偶联于介质表面，制得亲和层析介质。作为优选技术方案，步骤(2)中所述缓冲溶液种类可以为磷酸氢ニ钠-磷酸ニ氢钠体系、Tris-HCl体系或こ酸-こ酸钠体系中的任意一种或者至少两种的组合。作为优选技术方案，步骤(2)中所述的亲和配基的浓度为0.5?20mg/mL缓冲溶液，即每ml缓冲溶液中含有亲和配基0.5?20mg，优选I?18mg/mL缓冲溶液。缓冲溶液体积用量与氧化后的微球的质量比是5:1?20:1 (mL/g)。优选地，步骤(2)中所述反应温度例如为22°C、24°C、26°C、28°C、30°C、32°C、34°C、36 °C或38 °C，优选步骤(2 )中所述反应温度为室温(25 °C )。优选地，步骤(2)中所述反应时间例如为27h、31h、35h、本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种亲和层析介质，其特征在于，其以表面亲水化的超大孔聚丙烯酸酯类或其共聚物微球为基质，该基质具有孔径分布范围为200～500nm的孔道，且表面偶联有亲水性的多糖分子，含氨基的亲和配基通过醛基与基质进行偶联。
【技术特征摘要】
1.ー种亲和层析介质，其特征在于，其以表面亲水化的超大孔聚丙烯酸酯类或其共聚物微球为基质，该基质具有孔径分布范围为200~500nm的孔道，且表面偶联有亲水性的多糖分子，含氨基的亲和配基通过醛基与基质进行偶联。2.如权利要求1所述的层析介质，其特征在于，所述基质为表面亲水化的超大孔甲基丙烯酸缩水甘油醚与二乙烯基苯共聚物微球； 优选地，所述多糖选自琼脂糖、葡聚糖或蔗糖中的任意一种或者至少两种的混合物。3.如权利要求1或2所述的层析介质，其特征在于，所述亲和配基的分子量为IO4~IO7Da ； 优选地，所述亲和配基选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、Protein G、Protein A、こ肝表面抗原、破伤风疫苗或狂犬疫苗抗原中任意一种或者至少两种的组合。4.如权利要求1-3之一所述的层析介质，其特征在于，所述层析介质操作流速为0~3200cm/h，耐受压カ为0~2OMPa ； 优选地，所述层析介质在流速10~1600cm/h流速范围内，结合目标物动态载量变化20%。5.—种如权利要求1-4之一所述的亲和层析介质的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (1)选择性氧化:将表面亲水化的聚丙烯酸酯类或其共聚物微球表面的羟基选择性氧化为醛基，得到氧化后的微球； (2)偶联亲和配基:将亲和配基通过共价键化学键合到氧化后的微球表面。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述选择性氧化过程如下:将表面亲水化的聚丙烯酸酯类或其共聚物微球置于酸性溶液中，然后加入氧化剂，控制反应温度为30~60°C，反应2~12h后，得到氧化后的微球。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述酸性溶液的pH值为2~5; 优选地...
【专利技术属性】
技术研发人员：马光辉，张荣月，苏志国，叶佩丽，周炜清，李娟，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：
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