针对组织因子途径抑制剂(TFPI)的优化的单克隆抗体制造技术

本发明专利技术提供了结合人组织因子途径抑制剂(TFPI)的分离的单克隆抗体。还涵盖编码结合TFPI的单克隆抗体的分离的核酸分子。还提供了包含抗TFPI单克隆抗体的药物组合物和通过施用该抗体治疗凝固缺乏或缺陷的方法。还提供了生成所述抗体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对组织因子途径抑制剂(TFPI)的优化的单克隆抗体Zhuozhi Wang, Junliang Pan，Joanna Grudzinskaj Christian Votsmeierj Jan Tebbej Joerg Birkenfeldj Nina Wobstj Simone Briicknerj Susanne Steinigj Peter Scholz序列表提交与本申请有关的序列表经由EFS网以电子形式提交，并且在此通过提及而将其完整收入说明书中。专利
提供了结合人组织因子途径抑制剂(TFPI)的分离的单克隆抗体及其片段。专利技术背景血液凝固(blood coagulation)是血液形成稳定的凝块以使流血停止的过程 (process) 0该过程牵涉血液中循环的许多酶原和辅因子原(或“凝固因子”)。那些酶原和辅因子原经由序贯或同时将它们转化成活化形式的数种途径而相互作用。最后，所述过程导致在存在因子Va、离子钙、和血小板的情况中由激活的因子X(FXa)将凝血酶原激活为凝血酶。激活的凝血酶继而诱导血小板聚集，而且将血纤蛋白原转化成血纤蛋白，其然后被激活的因子XIII (FXIIIa)交联以形成凝块。可以通过两种独特的途径来实施导致因子X激活的过程接触激活途径(以前称为内源性途径)和组织因子途径(以前称为外源性途径)。先前认为，凝固级联由连接至共同途径的同等重要的两种途径组成。现在知道用于启动血液凝固的主要途径是组织因子途径。因子X可以被与激活的因子VII (FVIIa)联合的组织因子(TF)激活。因子VIIa和其必需的辅因子TF的复合物是凝固(clotting)级联的一种有力的引发剂(initiator)。凝固的组织因子途径受组织因子途径抑制剂(“TFPI，，)负控制。TFPI是FVIIa/TF 复合物的一种天然的、FXa依赖性反馈抑制剂。它是多价Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的成员。在生理学上，TFPI结合激活的因子X(FXa)以形成异二聚体复合物，其随后与FVIIa/ TF复合物相互作用以抑制其活性，如此关闭凝固的组织因子途径。原则上，阻断TFPI活性可以恢复FXa和FVIIa/TF活性，如此延长组织因子途径作用的持续时间，而且放大FXa的生成，所述FXa是血友病A和B的共同缺陷。实际上，一些初步实验证据已经指明，通过针对TFPI的抗体来阻断TFPI活性使延长的凝固时间正常化或者缩短流血时间。例如，Nordfang等显示了血友病血浆的延长的稀释凝血酶原时间(dilute prothrombin time)在用针对TFPI的抗体处理血楽■后正常化(Thromb. Haemost, 1991, 66 (4) : 464-467)。类似地，Erhardtsen 等显不了通过抗TFPI抗体显著缩短血友病A兔模型中的流血时间(Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1995，6:388-394)。这些研究提示了抗TFPI抗体对TFPI的抑制对于治疗血友病A或B可以是有用的。在这些研究中仅使用多克隆抗TFPI抗体。使用杂交瘤技术，制备并鉴定针对重组人TFPI (rhTFPI)的单克隆抗体。参见 Yang等，Chin. Med. J.，1998，111(8) : 718-721。测试了单克隆抗体对稀释凝血酶原时间(PT)和激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的影响。实验显示了抗TFPI单克隆抗体缩短因子IX缺乏型血浆的稀释促凝血酶原激酶凝固时间。提示了组织因子途径不仅在生理学凝固而且在血友病出血中发挥重要作用(Yang等，Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997，22(4) : 297-300)。因而，需要对TFPI特异性的抗体来治疗血液学疾病和癌症。一般而言，已经使用遗传工程来创建鼠的、嵌合的、人源化的或完全人的抗体以生成用于人疾病的治疗性抗体。显示了鼠单克隆抗体作为治疗剂具有有限的用途， 这是由于短的血清半衰期、不能触发人效应器功能、和人抗小鼠抗体的生成(Brekke 和 Sandlie, “Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of the Twenty-first Century, ” Nature 2, 53, 52-62，(2003 年 I 月)。已经显不了嵌合抗体引起人抗嵌合抗体应答。人源化抗体进一步使抗体的小鼠构件最小化。然而，完全人抗体完全避免与鼠元件有关的免疫原性。如此，需要开发完全人抗体以避免与其它形式的遗传工程化单克隆抗体有关的免疫原性。特别地，若使用具有鼠构件或鼠起源的抗体，则诸如用抗 TFPI单克隆抗体的血友病治疗会需要的长期(chronic)预防处理具有形成对该治疗的免疫应答的高风险，这是由于需要的频繁剂量给药和长的疗法持续时间。例如，血友病A的抗体疗法可以每周需要剂量给药，持续患者一生。这对免疫系统会是连续的考验。如此，需要用于血友病和相关的遗传性和获得性凝固缺乏或缺陷的抗体疗法的完全人抗体。已经经由由Koehler 和 Milstein 在“Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity, Mature 256, 495-497 (1975)中所描述的杂交瘤技术来生成治疗性抗体。也可以在原核生物和真核生物中重组生成完全人抗体。 治疗性抗体优选抗体在宿主细胞中的重组生成而不是杂交瘤生成。重组生成具有如下的优点，即较大的产物一致性、可能地较高的生产水平、和受控制的制备，其使动物衍生的蛋白质的存在最小化或消除动物衍生的蛋白质的存在。出于这些原因，想要具有重组生成的单克隆抗TFPI抗体。另外，因为TFPI以高亲和力结合活化的因子X(FXa)，所以有效的抗TFPI抗体应当具有相当的亲和力。如此，期望具有可以与TFPI/FXa结合竞争的结合亲和力的抗TFPI抗体。专利技术概述提供了针对人组织因子途径抑制剂(TFPI)的单克隆抗体。进一步提供了编码其的分离的核酸分子。还提供了包含抗TFPI单克隆抗体的药物组合物和治疗遗传性和获得性凝固缺乏或缺陷诸如血友病A和B的方法。还提供了用于缩短出血时间的方法，其通过对有此需要的患者施用抗TFPI单克隆抗体进行。还提供了用于生成依照本专利技术的结合人 TFPI的单克隆抗体的方法。在一些实施方案中，已经优化提供的针对TFPI的单克隆抗体，例如以具有升高的亲和力或升高的功能活性。附图简述图I描绘的柱状图显示了具有单个氨基酸取代的选择的2A8变体，其使用dPT测定法在人血友病A血浆中在缩短凝固时间上显示更多的效力。图2描绘的图显示了选择的单个氨基酸突变的抗TFPI抗体对抗因子VIII抗体诱导的人血友病血液的凝固时间的影响。图3描绘的图显示了与亲本4B7抗体相比且在更小程度上与2A8内的单个氨基酸取代相比，4B7-D62R在人抗体诱导的血友病A血液中在缩短凝固时间上具有多得多的效力。图4描绘的两幅图显示了与对照小鼠IgGl (CTX IgGl)相比以剂量依赖性方式用亲本抗体2A8和具有多个氨基酸取代的2A8变体(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：王卓智，潘俊亮，J格鲁德津斯卡，C沃特斯梅尔，J特贝，J伯肯菲尔德，N沃布斯特，S布吕克纳，S施泰尼希，P肖尔茨，
申请(专利权)人：拜耳医药保健有限公司，
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