本发明专利技术涉及一种应用生物反应器制备抗犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）将分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行无血清悬浮适应培养；2）在生物反应器内分两阶段培养所述杂交瘤细胞；3）收获培养上清液；4）超滤、冻干，制得成品。本发明专利技术应用生物反应器悬浮培养生产单克隆抗体的方法，克服了动物体内制备抗犬瘟热病毒单克隆抗体方法中所存在的产品杂蛋白含量高、质量不稳定、批间差大等缺陷，并具有培养基成分明确、方法和过程可控、抗体纯度高、操作简便、生产效率高等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及单克隆抗体
，具体涉及。
技术介绍
犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的一种高度接触性传染病，俗称狗瘟，该病的传染性极强，死亡率高达80%以上。接种犬瘟热疫苗是预防犬瘟热最为有效的途径之一。近年来，在广泛应用犬瘟热疫苗防治犬瘟热的同时，世界各地仍有犬或野生动物感染犬瘟热病毒，并造成犬瘟热流行的报道，且犬瘟热病毒的变异使得痊愈犬仍可传染犬瘟热病毒。单克隆抗体具有特异性高、灵敏性好和重复性优等特点，常用于诊断和治疗犬瘟 热病毒引起的相关疾病。其中，抗犬瘟热病毒的单克隆抗体为犬瘟热的诊断和治疗提供良好的基础。此外，抗犬瘟热单克隆抗体对犬瘟热的临床诊断、流行病学调查、病原学研究等方面都有积极和重要的意义。迄今为止，抗犬瘟热病毒单克隆抗体的制备方法主要采用动物体内培养法，所使用的生产动物多为BALB/c小鼠，具体步骤为1)将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，杂交瘤细胞在小鼠腹腔内生长并产生腹水；2)从所产生的腹水中提取分离杂交瘤细胞所生成的单克隆抗体。该方法制得的单克隆抗体浓度高，且具有操作简便、经济等优点，但产量有限，无法实现工业规模化生产，同时腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白(包括IgG)，需要提纯后才能使用，并有污染动物病毒的危险。因此，急需研究新的抗犬瘟热病毒单克隆抗体的制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，本专利技术的方法克服了传统动物体内生产工艺产品杂蛋白含量高、产品质量不稳定、批间差大等缺陷，具有培养基成分明确、过程和质量可控、抗体纯度高、操作简便、生产效率高、广品纯度闻、稳定性好等优点。本专利技术的技术方案为，包括如下步骤I)将分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行无血清悬浮适应培养；2)在生物反应器内分两阶段培养所述杂交瘤细胞；3)收获培养上清液；4)将收获的上清液进行超滤、冻干，制得抗犬瘟热病毒单克隆抗体成品。本专利技术的优选技术方案中，所述杂交瘤细胞株选自能够稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞株，优选所述的鼠杂交瘤细胞株为HB-216杂交瘤细胞株。本专利技术的优选技术方案中，步骤2)中在生物反应器内分两阶段培养杂交瘤细胞包括杂交瘤细胞的细胞生长阶段和抗体分泌阶段，其中，细胞生长阶段以获取细胞量为主，抗体分泌阶段以持续获得大量分泌性抗体为主。本专利技术的优选技术方案中，所述细胞生长阶段的培养条件为温度为36°C -37搅拌转速为 120 RPM -180RPM、溶氧(DO)为 30%_80% 和 pH 为 7. 0-7. 2。本专利技术的优选技术方案中，所述抗体分泌阶段的培养条件为温度为34°C -35搅拌转速为 120RPM-180RPM、溶氧(DO)为 30%_80% 和 pH 为 7. 2-7. 4。本专利技术的优选技术方案中，所述生物反应器选自搅拌式生物反应器、激流式生物反应器中的任一种或其组合。本专利技术的优选技术方案中，步骤2 )生物反应器内分两阶段培养所用的培养基选自Hybridoma-SFM无血清培养基、PFHM-II无血清培养基中的任一种或其组合。本专利技术的优选技术方案中，步骤2)中生物反应器内的培养方法选自分批培养法、 补料分批培养法、灌注培养法中的任一种或其组合。本专利技术的优选技术方案中，所述分批培养法为在生物反应器内放入一定量的培养基后，接入适量细胞，使其生长繁殖，一次性收获产品。本专利技术的优选技术方案中，所述补料分批培养法为在分批培养过程中补加新鲜的培养基或营养物质，一次性收获产品，其中，补料所用培养基为原倍培养基或浓缩了 2-5倍的培养基，优选为浓缩了 3-4倍的培养基，并间歇补加营养物质或流加营养物质，其中，所述的营养物质选自葡萄糖、谷氨酰胺、酵母提取物、乳清蛋白水解物的任一种或其组合。本专利技术的优选技术方案中，所述灌注培养法为细胞接种生物反应器后所进行的培养，新鲜的培养基不断加入生物反应器，同时又连续不断的排出废液或连续收获产品，其中，优选的灌注体积为O. 5-3个工作体积/天，通过更改蠕动泵转速来调节灌注速率。本专利技术的优选技术方案中，步骤2)中生物反应器内的培养方法选自单级培养法、逐级放大培养法的任一种或其组合，单级培养法优选为14L单级培养法、逐级放大培养法优选为14L-75L-650L逐级放大培养法。本专利技术的优选技术方案中，所述14L单级培养法以摇瓶培养细胞为种子细胞，将其接种到14L搅拌式生物反应器中进行培养，并产生抗体。本专利技术的优选技术方案中，所述14L-75L-650L逐级放大培养法以14L生物反应器培养细胞为种子细胞，再将种子细胞放大到75L生物反应器中培养，再以75L生物反应器中培养的细胞作为种子细胞，将其放大到650L生物反应器进行培养，并产生抗体。本专利技术的优选技术方案中，步骤3 )所述的收获培养上清液为收获抗体上清，其中，所述培养上清液的收获法选自批式收获法、间歇收获法、连续收获法中的任一种或其组合，优选为连续收获法。本专利技术的优选技术方案中，步骤4)所述的超滤是指将收获的抗体上清进行抗体超滤浓缩，其中，超滤所用膜包的孔径选自5kD超滤膜、8kD超滤膜的任一种或其组合。为了清楚地表述本专利技术的保护范围，本专利技术对下述术语进行如下界定本专利技术所述的“生物反应器”是指通过体外模拟微生物体内生长及代谢环境的一种具有生物功能的设备，其包括但不限于本专利技术所述的“搅拌式生物反应器”或“激流式生物反应器”。本专利技术所述的“生物反应器放大”是指在利用生物反应器培养细胞的过程中，将各项指标(包括细胞生长动力学、热力学、细胞代谢及细胞生理状态等)从小规模生物反应器放大到大规模生物反应器上进行再现或者加以优化的一项综合性技术。一般通过优化生物反应器的物理结构、建立数学模型及代谢调控策略来实现生物反应器的放大过程，其包括但不限于本专利技术所述的“生物反应器逐级放大”。本专利技术所述的“杂交瘤细胞”是将具有无限分裂、增殖能力的SP2/0骨髓瘤细胞和具有抗犬瘟热病毒抗体 分泌功能的小鼠脾淋巴细胞经聚乙二醇(PEG)介导细胞融合而成，所形成的杂交瘤细胞同时具有无限增殖和抗体分泌两种细胞特性，包括但不限于本专利技术实施例所例举的HB-216杂交瘤细胞。除非另有说明，本专利技术涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本专利技术涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本专利技术涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。与现有技术相比，本专利技术具有下述有益技术效果I、本专利技术提供了一种应用生物反应器无血清悬浮培养杂交瘤细胞以制备抗犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，该方法不在培养基中添加牛血清，从而避免了牛血清对抗体分泌的影响，也克服了血清中异种蛋白的残留(如导致过敏反应)对抗犬瘟热病毒单克隆抗体质量的影响，并避免了污染动物病毒的风险，且所制备的抗犬瘟热病毒单克隆抗体具有组分明确，产品质量优等优点。2、本专利技术的制备方法将杂交瘤细胞在生物反应器中分两阶段培养，包括细胞生长阶段和抗体分泌阶段，其中，细胞生长阶段获得了大量的细胞质，抗体分泌阶段持续大量地获取了分泌性单克隆抗体，显著优化了细胞的生长及抗体的分泌表达，有效地改善和提高了抗体的表达水平。3、本专利技术采用单级培养法或逐级放大培养法，实现了制备过程的自动化控制，大大降低了生产成本，提高了产品的质量本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种应用生物反应器制备抗犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于包括如下步骤：1）将分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行无血清悬浮适应培养；2）在生物反应器内分两阶段培养所述杂交瘤细胞；3）收获培养上清液；4）将收获的上清液进行超滤、冻干，制得抗犬瘟热病毒单克隆抗体成品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，刘洁，秦红刚，漆世华，温文生，朱薇，谢红玲，韩兴，王桢桢，廖园园，李建，王威，
申请(专利权)人：武汉中博生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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