本发明专利技术属于纳米分子的合成及基因工程技术领域，具体涉及到壳聚糖-NS1shRNA纳米复合物的制备方法。把壳聚糖纳米颗粒、NS1shRNA按一定的比例混合，通过静电的作用形成壳聚糖-NS1shRNA纳米复合物，利用壳聚糖作为载体把病毒的NS1基因、shRNA导入哺乳动物细胞中，和宿主细胞的模式识别受体RIG-I样受体(RIG-I?likereceptors,RLRs)结合，能结合shRNA并激活下游的信号级联反应,激活天然免疫系统和乳细胞内抗病毒的干扰素通路，诱导I型干扰素的产生，最终清除感染体内的病毒。本发明专利技术使用壳聚糖作为基因药物的生物体外及生物体内给药系统，取得了很好的效果，能应用于shRNA的体内外转染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纳米分子的合成及基因工程技术，具体涉及到壳聚糖-5’ PPP-NSlshRNA纳米复合物的制备方法。
技术介绍
维甲酸诱导基因I (retinoic acid inducible gene I，RIG-I)为我国学者于 1997年从人急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)NB4细胞株中首次克隆。RIG-I作为胞质shRNA受体，通过其helicase结合shRNA和ATP，ATP水解致RIG_I_shRNA 构象改变，暴露其CARD，与下游接头蛋白质干扰素启动子刺激因子-I (IPS-I)的CARD相互作用，下传信号，激活NF-KB和IRF等转录因子，诱导I型干扰素的表达和分泌，引发抗病毒天然免疫应答。但裸露的shRNA进人组织后迅速被组织内的RNase水解，因此需要构建一个能有效保护RNA并能被组织更好吸收的RNA运载体系。本专利采用分步法制备的RNA壳聚糖纳米粒，制备方法简单、可行，制剂稳定性，对包裹的RNA具有较好的保护作用。其实验结果显示壳聚糖与RNA形成表面带正电荷的纳米颗粒，使RNA被保护不受RNase的降解；壳聚糖_5’ppp-NS I shRNA纳米复合物能激活RIG-I，诱导I型干扰素的表达和分泌。5’ppp-NSlshRNA是流感病毒的RNA，壳聚糖-5’ ppp -NSlshRNA纳米复合物的研制为进一步研究通用流感病毒疫苗奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种壳聚糖_5’ ppp -NSlshRNA纳米复合物的制备方法。并公开壳聚糖-5’ppp -NSshRNA纳米复合物作为制备基因药物载体方面的应用。本专利技术使用壳聚糖作为基因药物载体生物体内给药系统，取得了很好的效果。壳聚糖及其衍生物具有良好结黏附性，广泛用于祀向给药。壳聚糖及其衍生物和病毒外膜蛋白NSl shRNA通过静电作用形成复合物，保护shRNA免于核酶降解、提高细胞摄取及胞内shRNA释放，已成功应用于shRNA的体内转染。本专利技术利用壳聚糖作为载体，把流感病毒的NSlshRNA转染细胞中，进入细胞中的NSlshRNA被RIG-I所识别后，诱导RIG-I发生构象改变，暴露出原来隐蔽在蛋白质内部的CARD,以便与下游信号衔接蛋白VISA(又称为IPS1、MAVS或Cardif)的CARD结构域相互作用。VISA位于线粒体外膜，可通过细胞质内的TRAF3将RIG-I的激活信号传递给下游的TBKl和IKK蛋白激酶，导致IRF3/7和NF_kB的激活和干扰素基因的表达，引发抗病毒天然免疫应答。壳聚糖-NSlshRNA纳米复合物的制备方法包括以下步骤 第一步壳聚糖纳米颗粒的制备方法壳聚糖，脱乙酰度>85%，粘度< 100。本专利技术使用的药品全部是分析级试剂，所制备的纳米颗粒形态大多成球形，平均粒径约为480nm，多分散度〈O. 25，zeta电位约为25 mV。第二步病毒外膜蛋白NSl基因的获得和5’ ppp- shRNA的合成病毒的NS基因(890 bp)编码非结蛋白NS1、NS2。每个节段的两端具有末端重复序列，所有节段的3端核苷酸序列相同。5端有与3端核苷酸序列互补的保守区段和重复序列。根据NCBI登录的流感病毒A/PR/8/1934 (HlNl)株的NSl基因，我们进行了设计，选取了其中21个碱基序列用于本实验的研究，碱基序列为TGAGGATGTCAAAAATGCAGT。委托鼎国生物公司合成了 21个核苷酸的NSlshRNAj^WT 5’ ppp的帽状结构。第三步壳聚糖_5’ ppp-NSlshRNA纳米复合物的合成 把壳聚糖纳米颗粒、5’ ppp-NS I shRNA按质量比为1:5的比例混合,壳聚糖纳米颗粒带有正电荷，5’ppp-NSl shRNA带有负电荷，通过静电的作用形成壳聚糖-5’ppp-NSlshRNA纳米复合物；用5%琼脂糖凝胶电泳检测壳聚糖与5’ ppp- NSlshRNA的结合情况。本专利技术使用的天然阳离子聚合物壳聚糖，具有生物可降解、无免疫原性及低毒等特性，其分子结构中具有活泼氨基，可连接不同功能基团，如质子化基团(季铵基团)、PH敏感基团、巯基和各种细胞表面受体特异性配体等，形成壳聚糖衍生物。壳聚糖及其衍生物具 有良好的黏附性，广泛用于靶向给药。壳聚糖及其衍生物和病毒NSlshRNA通过静电作用形成复合物，保护shRNA免于核酶降解、提高细胞摄取及胞内shRNA释放，并能成功将shRNA转染细胞内。转染细胞内的shRNA能靶定RIG-I基因，诱导RIG-I发生构象改变，以便与下游信号衔接蛋白VISA相互作用，导致IRF3/7和NF_kB转录因子的激活和诱导干扰素基因的表达，引发抗病毒天然免疫应答。具体实施方案 本专利技术的具体实施包括以下内容 实施例I: 第一步壳聚糖纳米颗粒的制备 I、微乳液A的合成22 mL环己烷；8 mL己醇；200 μ L壳聚糖；400 μ L壳聚糖-Rh ；2.6 mL Triton XlOO，将上述溶液混合，搅拌30分钟，直到得到溶液清晰，得到微乳液A。2、微乳液B的合成 在尚心管中放入分子质量为150. 09的NHS 100 μ L ;分子质量为115. 09的酒石酸200μ L ;分子质量为190的EDC 300 μ L，将上述溶液混合，终浓度为O. 2Μ。溶液静止20分钟后，把全部溶液放到微乳液A中去，搅拌过夜(至少16小时)，得到微乳液B。3、在上述微乳液B中溶液中加入I mL的乙醇溶液，8，000 rpm，离心20 min，去上清。添加ImL的乙醇，8000 rpm，再离心10分钟，再重复以上步骤两次。获得的壳聚糖纳米颗粒在I - 2 mL HPLC级水中再溶解；在去离子水中透析的I-2天(每天换水)。第二步病毒外膜蛋白NSl基因的获得和5’ ppp- NSlshRNA的合成 病毒的NS基因(890 bp)编码非结蛋白NS1、NS2。每个节段的两端具有末端重复序列，所有节段的3端核苷酸序列相同。根据NCBI登录的流感病毒A/PR/8/1934(HlNl)株的NSl基因，选取其中21个碱基，委托鼎国生物公司合成21个核苷酸的NSlshRNA，加了5’ ppp 的帽状结构，碱基序列为5’ ppp-TGAGGATGTCAAAAATGCAGT。第三步壳聚糖_5’ ppp - NSlshRNA纳米复合物的合成 把壳聚糖纳米颗粒、5’ ppp -NSl shRNA的水溶液按质量比的I :5比例混合，形成壳聚糖-5’ppp - NSlshRNA纳米复合物。用5%琼脂糖凝胶电泳检测壳聚糖与5’ppp - NSlshRNA的结合情况。实施例2: 壳聚糖-5’ ppp - NSlshRNA纳米复合物的应用 I.细胞转染实验取对数生长期的B16-BlueINF_a/i3细胞，使消化后细胞的浓度在4. 2X105cell/ml，取180ul/孔细胞液接种于96孔板培养板上，每孔加20 ul的壳聚糖-5’ppp - NSlshRNA纳米复合物，壳聚糖纳米颗粒、5’ppp -NSl shRNA的水溶液按质量比的I :5混合，将细胞培养板置于CO2培养箱中，37°C培养，培养24h。本文档来自技高网...
【技术保护点】
壳聚糖？5’ppp？？NSshRNA纳米复合物的制备方法，其特征是：第一步？壳聚糖纳米颗粒的制备：1）、微乳液A的合成：22？mL环己烷；8？mL己醇；200？μL？壳聚糖；400？μL壳聚糖？？Rh；2.6？mL？Triton？X100？混合，搅拌，直到得到溶液清晰，得到微乳液A；2）、微乳液B的合成：在离心管中放入MW？为？150.09的100？μL？NHS？()；MW？为？115.09的200？μL酒石酸；MW？为？190的300？μL？EDC离心使溶液应该达到0.2M，静止20分钟，然后把全部溶液放到微乳液A中去，搅拌过夜，至少16小时，得到微乳液B；3）、在上述微乳液B中溶液中加入1？mL的乙醇溶液，8,000？rpm离心，去上清然后添加1mL的乙醇，？8000？rpm，再离心，再重复以上步骤两次，获得的壳聚糖纳米颗粒在1？？？2？mL？HPLC级水中再溶解，在去离子水中透析的1？？？2天？，每天换水；第二步？病毒外膜蛋白NS1基因的获得和5’ppp？？NS1shRNA的合成：病毒的NS基因890？bp编码非结蛋白NS1、NS2，每个节段的两端具有末端重复序列，所有节段的3？端核苷酸序列相同，根据NCBI？登录的流感病毒A/PR/8/1934(H1N1)株的NS1基因，选取其中19个碱基，委托鼎国生物公司合成19个核苷酸的NS1shRNA,加了5’ppp？的帽状结构，碱基序列为：5’ppp？TGAGGATGTCAAAAATGCA；第三步？壳聚糖？5’ppp？？？NS1shRNA纳米复合物的合成：把壳聚糖纳米颗粒、5’ppp？NS1？shRNA的水溶液按质量比的1：5比例混合，形成壳聚糖？5’ppp？？？NS1shRNA纳米复合物，用5%凝胶电泳检测壳聚糖与5’ppp？NS1shRNA的结合情况。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵丽辉，赵赫楠，韩德明，贾凯莉，王丽丽，
申请(专利权)人：长春理工大学，
类型：发明
国别省市：
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