本发明专利技术提供一种壳聚糖酶复合热变性保护剂，包含如下浓度的组分：硼砂10‑23克/L；氯化钙80‑120克/L；甘油45‑65g/L。本发明专利技术另一个方面还提供一种壳聚糖酶液，是将壳聚糖酶加入到上述的保护剂中制成的；所述的壳聚糖酶mEAG1的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。采用本发明专利技术提供的复合热变性保护剂，大大提高了壳聚糖酶的热稳定性，40℃条件下保存90天，壳聚糖酶的活力始终维持在90％以上，具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种壳聚糖酶复合热变性保护剂。
技术介绍
酶的失活是限制酶制剂工业生产和应用的重要因素，因为酶的热稳定性及贮存稳定性是酶制剂能否大规模生产和商品化的关键，因此如何提高酶的热稳定性和减少酶的失活是近年来生物化工领域研究的热点。酶的热稳定性,对于酶的应用具有现实意义。一般酶促反应温度每升高10℃，反应速度增加1-2倍,因此在用酶量不变的情况下,可以大大缩短生产周期,减少设备投资。目前，酶的稳定化的主要方法有3种，即添加保护剂、化学修饰和固定化处理。由于方法简单、成本低下和易于操作等多方面原因，添加保护剂是目前工业上提高酶稳定性的最重要手段。目前研究较多的是单一热变性保护剂，对复合热变性保护剂的研究报道很少，现今国内外尚无采用复合保护剂提高壳聚糖酶的热稳定性的相关报道。壳聚糖酶是一种多糖水解酶，它能有效的切断壳聚糖分子中的β-1,4糖苷键，产生具有不同分子量大小与不同生物学功能的壳寡糖。在利用壳聚糖酶制备壳寡糖的工业应用中，大多数酶解过程需要在45度以上的环境中进行，而且酶解的周期相对较长。高温过程中的酶失活迫使实际生产中需要连续补充壳聚糖酶，这不仅增加了生产成本，而且大大降低了工作效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术中存在的不足，提供一种壳聚糖酶复合热变性保护剂。本专利技术首先提供一种壳聚糖酶复合热变性保护剂，所述保护剂包含如下浓度的组分：硼砂10-23克/L；氯化钙80-120克/L；甘油45-65g/L；本专利技术另一个方面还提供一种壳聚糖酶液，是将壳聚糖酶加入到上述的保护剂中制成的；所述的壳聚糖酶，为壳聚糖酶EAG1的一种变体(mEAG1)作为优选，所述的壳聚糖酶mEAG1的氨基酸序列为SEQIDNO：1；采用本专利技术提供的复合热变性保护剂，大大提高了壳聚糖酶的热稳定性，40℃条件下保存90天，壳聚糖酶的活力始终维持在90％以上，具有广泛的应用前景。附图说明图1：壳聚糖酶mEAG1的稳定性试验响应面示意图；图2：壳聚糖酶mEAG1的稳定性试验图；图3：不同保护剂对mEAG1的稳定性影响图。具体实施方式实施例1复合热变性保护剂的配制量取蒸馏水500ml,加入硼砂10克，升温至45度，搅拌20分钟，加入无水氯化钙80克，搅拌15分钟，冷却至室温，静置30分钟，加入甘油45g，定容至1000ml,115度灭菌25分钟，冷却至室温。实施例2复合热变性保护剂的配制量取蒸馏水500ml,加入硼砂23克，升温至45度，搅拌20分钟，加入无水氯化钙120克，搅拌15分钟，冷却至室温，静置30分钟，加入甘油65g，定容至1000ml,115度灭菌25分钟，冷却至室温。实施例3复合热变性保护剂的配制量取蒸馏水500ml,加入硼砂20克，升温至45度，搅拌20分钟，加入无水氯化钙95克，搅拌15分钟，冷却至室温，静置30分钟，加入甘油55g，定容至1000ml,115度灭菌25分钟，冷却至室温。实施例4含壳聚糖酶mEAG1的复合热变性保护剂mEAG1突变体是对壳聚糖酶EAG1(GenBank登录号AB008788)进行突变获得的，将mEAG1突变体置于50℃孵育0-80分钟，随后转移至冰上冷却5分钟，37度条件下测定残余的壳聚糖酶活力，结果表明50℃下mEAG1的半衰期明显提高，EAG1在50℃下保温10分钟，酶活力下降了50％，保温50分钟后酶活力下降了95％。mEAG150℃下半衰期提高到70分钟，比EAG1提高了7倍。壳聚糖酶的活力测定：壳聚糖酶的活力测定采用二硝基水杨酸(DNS)方法。酶活单位定义：1U表示在上述条件下每分钟释放1μmol还原糖所需要的酶量。为测定壳聚糖酶mEAG1对壳聚糖的Km和Vmax，将0.5mL不同浓度的壳聚糖溶液(5、7.5、10、15、20mg/mL)分别与0.1mLmEAG1(最终酶浓度5.0U/mL)混合。37℃反应10min，加入4.0mL10％TCA溶液终止反应。根据双倒数作图法(Lineweaver-Burk)以1/[S]为横坐标1/v为纵坐标作图，直线的的斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax，计算出动力学常数Km和最大反应速度Vmax(表1)。与EAG1相比，mEAG1的最大反应速度(Vmax)与催化效率(Kcat/Km)分别提高了142％与203％。表1：EAG1与mEAG1的动力学参数表结果表明壳聚糖酶mEAG1特异性强，可以以内切方式有效的打断壳聚糖中的β-1,4糖苷键。每克壳聚糖添加1.0U单位的EAG1突变体，45℃下水解4个小时，可以将壳聚糖完全分解成聚合度2-8糖的壳寡糖，水解率达到95％以上。称取mEAG1粉末100g,溶解于100ml磷酸盐缓冲液中，所述的磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠，浓度为0.01M，pH为6.0,搅拌至全部溶解，定容至1000ml.将上述含mEAG1的酶液与上述无菌保护剂按体积比2:1混合。实施例5分别将壳聚糖酶mEAG1水溶液，含壳聚糖酶mEAG1的复合热变性保护剂与含壳聚糖酶mEAG1的其它A品牌保护剂40℃条件下避光保存90天，测定残余壳聚糖酶活力。图3表明，没有添加保护剂的情况下，壳聚糖酶mEAG140度条件下48h后,酶活力下降了75％。添加保护剂的壳聚糖酶mEAG1的热稳定性明显提高，其中添加A品牌保护剂酶活力逐步降低，40℃条件下保存90天，保留酶活力降至75％。添加本专利所述保护剂，40℃条件下保存90天，壳聚糖酶的活力始终维持在90％以上。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种壳聚糖酶复合热变性保护剂，其特征在于，所述保护剂包含如下浓度的组分：硼砂10‑23克/L；氯化钙80‑120克/L；甘油45‑65g/L。
【技术特征摘要】
1.一种壳聚糖酶复合热变性保护剂，其特征在于，所述保护剂包含如下浓
度的组分：硼砂10-23克/L；氯化钙80-120克/L；甘油45-65g/L。
2.一种壳聚糖酶液，其特征在于，所述的壳聚糖酶液是将壳聚糖酶加入到
权...
【专利技术属性】
技术研发人员：盛军，沙珍霞，郑媛，纪晓峰，王致鹏，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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