用于免疫疗法的抗原负载壳聚糖纳米颗粒制造技术

本发明专利技术涉及包含壳聚糖和抗原的纳米颗粒，由此所述壳聚糖具有约90％的脱乙酰度和5kDa至80kDa的分子量，涉及含有此类颗粒的微粒以及涉及此类颗粒的制备方法。所述颗粒可用于接种疫苗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及包含壳聚糖和抗原的纳米颗粒，由此壳聚糖具有约90％的脱乙酰度和5kDa至80kDa的分子量，涉及含有此类纳米颗粒的微粒以及涉及制备此类颗粒的方法。所述颗粒可用于接种疫苗。在20多年前，发现甲壳素衍生物包括壳聚糖具有免疫刺激活性。该免疫刺激活性，与甲壳素衍生物和葡聚糖(一种免疫佐剂类的天然多糖)之间的结构相似性一起，引导多位科学家研究壳聚糖的佐剂性能。关于壳聚糖及其衍生物的研究聚焦于其在与其它佐剂结合时对于免疫应答的影响。由于其粘膜粘附性质，壳聚糖已被作为用于粘膜接种疫苗的佐剂来探索。由壳聚糖造成的疫苗增强的机理被认为是归因于经由粘膜粘附在鼻通道中的疫苗的保留和用于疫苗的细胞旁路转运的内皮细胞连接的打开这两者(Ilium等人，2001AdvDrugDev51(l-3):81-96)。壳聚糖的佐剂性质也已在对抗传染疾病和用于癌症疫苗的皮下疫苗制剂方面被探索(Invivoevaluationofchitosanasanadjuvantinsubcutaneousvaccineformulations,R.Scherlieβ等人,Vaccine2013；Chitin,Chitosan,andGlycatedChitosanRegulateImmuneResponses:TheNovelAdjuvantsforCancerVaccine,X.Li等人,ClinandDevImmunol,2013)。颗粒疫苗也已在文献中被描述为具有佐剂性质(例如Pathogenrecognitionanddevelopmentofparticulatevaccines:Doessizematter？,S.Xiang,Methods,2006)。US2004/0037840A1(新型治疗性疫苗制剂)公开了针对多肽抗原的免疫应答可由与此类多肽抗原混合的壳聚糖诱导，并且公开了作为用于此的优选制剂的微粒。最优选的是所述微粒具有0.73和0.82μm之间的平均粒径和壳聚糖具有约95,000至约3,000,000的平均分子量和至少98％的脱乙酰度(DD)。尽管有描述于现有技术中的制剂，仍存在对于其它制剂，特别是与现存的制剂相比较提供改善的效力的制剂的持续需求。因此，本专利技术的一个目标是提供此类制剂。令人惊讶地，本专利技术已发现由含有抗原的壳聚糖纳米颗粒诱导的免疫应答急剧增强，若此类纳米颗粒的壳聚糖具有约90％的脱乙酰度(DD)和5千道尔顿(kDa)至80千道尔顿(kDa)的分子量的话。该发现与现有技术教导形成清晰的对比，现有技术教导颗粒中的壳聚糖的DD值应当优选尽可能地高(至少98％)并且壳聚糖应当优选具有在一范围内的平均分子量，该分子量比本专利技术的纳米颗粒的那些高得多，本专利技术的纳米颗粒的分子量已证明提供了增强的效果。因此，本专利技术的一个目的是涉及包含壳聚糖和抗原的纳米颗粒，其特征在于壳聚糖具有约90％的脱乙酰度和5kDa至80kDa的分子量。如本文所使用的，“一”(\a\或\an\)应当表示一或更多。如本文所使用的，当连同单词“包含”使用时，单词“一”表示一或多于一。如本文所使用的“另一”表示至少第二或更多。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语包括复数，且复数术语包括单数。如本文所使用的，术语“纳米颗粒”是指具有小于1μm的平均尺寸的颗粒。纳米颗粒优选具有规则形状，例如球形，但也可具有不规则形状。如本文所使用的，术语“微粒”是指具有大于1μm的平均尺寸的颗粒。微粒可具有规则形状，例如球形，或不规则形状。在一个实施方式中，微粒由纳米颗粒和赋形剂构成，所述赋形剂能够提供纳米颗粒的充分的粘合以形成具有用于它们各自用途所需的充分的物理稳定性的微粒。合适的赋形剂可为，例如，具有粘合性质的赋形剂，诸如，例如糖或糖醇。如本文所使用的，术语“壳聚糖”是指由无规分布的β-(1-4)-连接的D-葡糖胺(脱乙酰单元)和N-乙酰基-D-葡糖胺(乙酰化单元)组成的线性多糖。壳聚糖通过甲壳素的脱乙酰化来商业生产，甲壳素为N-乙酰基-D-葡糖胺的多糖。不同的壳聚糖可通过与甲壳素相比较的分子量、粘度和脱乙酰度(DD)来表征。除了壳聚糖之外，能够与抗原形成纳米颗粒的其衍生物或类似物也可用于本专利技术的目的。此类类似物或衍生物可为改性壳聚糖，其中所述改性用于改变其物理、化学或生理学性质。这种类似物可通过归因于静电和/或亲水性和/或疏水性相互作用的非共价附着或通过与壳聚糖的共价结合来形成。类似物的实例包括，但不限于，通过在其上结合特异性或非特异性靶抗原和/或膜透化剂和/或内吞体裂解剂(endosomolyticagent)和/或核定位信号来改性的壳聚糖。其它实例是衍生的甲壳素或壳聚糖或以上提及的类似物，即，O-乙酰化和/或N-乙酰化和/或N-三甲基化壳聚糖或类似物。可通过静电相互作用使阴离子性分子(例如佐剂Poly(I:C)(聚肌苷酸:聚胞苷酸))附着至阳离子性N-三甲基化壳聚糖。基于壳聚糖的化合物可有利地进行交联，要么自然交联要么借助交联剂或胶凝剂例如戊二醛(Akbuga和Durmaz1994IntJofPharm111,217–222；Aiedeh等人1997J.Microencapsul.14,567–576；Jameela,S.R.等人1995Biomaterials16,769–775)、甲醛或藻酸盐凝胶作用(Liu,L.S.等人1997J.ControlRel.43,65–74；Alexakis,T.等人1995.Appl.Biochem.Biotechnol.50,93–106；PolkA.等人1994J.Pharm.Sci.83,178–185)进行交联。如本文所使用的，术语“抗原”是指能够在脊椎动物，优选哺乳动物中引起细胞和/或体液免疫应答的蛋白质、多肽、肽或碳水化合物的全部或部分。在一个实施方式中，所述抗原是蛋白质、多肽、肽或核酸。在另一实施方式中，所述蛋白质、多肽或肽可为糖基化的。如本文所使用的，术语“脱乙酰度”(DD)是指壳聚糖分子中的游离氨基相对于相应的甲壳素分子的N-乙酰基的最大可能数目的百分比。壳聚糖最常通过甲壳素的碱性脱乙酰化来制备，由此乙酰基被从甲壳素的N-乙酰基-D-葡糖胺单元中脱除，留下游离氨基(-NH2)。用于测定壳聚糖的脱乙酰度的方法在本领中广泛已知并且包括各种方法，例如茚三酮试验、线性电位滴定、近红外光谱、核磁共振光谱、溴化氢滴定分析、红外光谱和一阶导数紫外分光光度法(KhanTA,JPharmPharmaceutSci5(3):205-212,2002)。重均分子量(Mw)通过静态光散射(SLS)来测定(Scherlieβ,R.,Buske,S.,Young,K.,Weber,B.,Rades,T.和Hook,S.,InvivoevaluationofchitosanasanadjuvantinsubcutaneousvaccineformulationsVaccine31(2013)4812-4819)。SLS通常用于测定多糖的Mw[WuH.CorrelationsbetweentheRayleighratioandthewavelengthfortolueneandbenzene.Chemica本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含壳聚糖和抗原的纳米颗粒，其特征在于所述壳聚糖具有约90％的脱乙酰度和5kDa至80kDa的分子量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.06 EP 14001974.61.包含壳聚糖和抗原的纳米颗粒，其特征在于所述壳聚糖具有约90％的脱乙酰度和5kDa至80kDa的分子量。2.根据权利要求1的纳米颗粒，其特征在于所述壳聚糖具有10kDa至70kDa、优选20kDa至60kDa且更优选25kDa至50kDa的分子量。3.根据权利要求1或2的纳米颗粒，其特征在于所述纳米颗粒具有100nm至500nm、优选200nm至400nm且更优选200nm至300nm的平均尺寸。4.根据权利要求1至3中的一项或更多项的纳米颗粒，其特征在于它们含有抗衡离子。5.根据权利要求4的纳米颗粒，其特征在于所述抗衡离子是羧甲基纤维素、三聚磷酸五钠、胆酸钠、肝素、低分子量透明质酸、藻酸盐、果胶、角叉菜胶或聚丙烯酸。6.根据权利要求1至5中的一项或更多项的纳米颗粒，其特征在于所述抗原是肽、蛋白质或核酸。7.根据权利要求1至6中的一项或更多项的纳米颗粒，其特征在于其含有佐剂。8.根据权利要求1至7的纳米颗粒，用于接种疫苗。9.根据权利要求1至7中的一项或更多项的纳米颗粒用于治疗性接种疫苗，优选用于癌症接种疫苗的用途。10.根据权利要求9的用途，其特征在于通过粘膜给药或通过肠胃外注射施用所述纳米颗粒。11.根据权利要求10的用途，其特征在于所述粘膜给药是肺或鼻给药。12.用于制备根据权利要求1至7中的一项或更多项的纳米颗粒的方法，其特征在于通过离子凝胶化制备所述纳米颗粒。13.根据权利要求12的方法，其包括以下步骤：a)制备包含壳聚糖和抗原的水溶液；b)制备包含抗衡离子的水溶液；c)将在步骤(a)中制备的水溶液和通...

【专利技术属性】
技术研发人员：A哈内费尔德，M魏冈特，M沃尔夫，P克诺勒，M施勒德，R舍利斯，P瓦尔登，A迪德里希，H施特克尔，RB巴莱罗，
申请(专利权)人：默克专利股份公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE