本发明专利技术获得了一种含有靶向HIV-1特异性siRNA的生物纳米粒，该生物纳米粒具有HIV-1特异基因沉默作用。所述siRNA选自SEQ?ID?NO:1～SEQ?ID?NO:6所示序列的1～6种。本发明专利技术在人CD4+T淋巴细胞和人造血干细胞（Human?Hematopoietic?Stem?Cell,hHSC）中检测了获得的生物纳米粒对HIV活病毒的抑制效率，证实了其可直接作为防治艾滋病的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种具有Hiv-I特异基因沉默作用的SiRNA生物纳米粒，本专利技术还涉及所述生物纳米粒的制备方法，以及在制备防治艾滋病药物方面的应用。
技术介绍
基因治疗是当前艾滋病治疗的新方法。RNA干扰(RNA interference, RNAi)又称为依赖于RNA的基因沉默机制，是通过双链RNA (double-strand RNA, dsRNA)特异性地抑制与其序列同源的靶基因mRNA表达的现象。即在胞质中，双链RNA引发了同源mRNA的降解，故也被称为转录后基因沉默现象(post-transcriptional gene-silencing, PTGS)。RNAi治疗AIDS的研究现状 siRNAs或miRNAs可以特异地结合靶mRNA，弓I起靶mRNA降解或翻译抑制，最终导致基因特异性沉默。RNAi技术很可能为抗HIV治疗的研究打开突破口。基因沉默靶点的确立HIV-I基因组编码区由9个开放读框组成，包括3个结构基因(gag、pol、env),2个调节基因(tat、rev)和4个辅助基因(vif、vpr、vpu、nef )。非结构基因曾被认为不是HIV-I病毒复制所必需的“非必需基因”，但是近年来越来越多的研究表明HIV-I的非结构基因在病毒的致病机理、感染性、潜伏上都有着重要的作用，因此本专利技术将非结构基因作为抗病毒治疗的靶点。HIV-ITat蛋白不仅参与反式激活病毒的表达，还参与AIDS相关疾病的病理机理，如神经毒性作用、致癌原性、免疫抑制原性等，在HIV-I的病毒复制及致病中都起了重要的作用。Rev蛋白可以与Rev应答元件(Rev response element, RRE)结合,介导未拼接和不完全拼接的mRNA从胞核向胞浆内的转运，促进病毒结构蛋白和酶的合成，引发HIV基因表达由早期向晚期的转换。Vpr可以在病毒复制的早期，反式激活HIV-1LTR，促进病毒基因的表达；介导和增强整合前复合体的核转运；改变细胞基因的表达，诱导细胞周期G2/M期阻滞及细胞凋亡。病毒感染因子(Viral Infectivity Factor,Vif)可以抵抗载脂蛋白 B mRNA 编辑酶催化多妝样蛋白 3G(human protein apoliproteinB mRNA-editingenzyme-catalytic polypeptide-1 ike~3G, AP0BEC3G)的抗病毒活性，增强 HIV-1 毒粒的感染力。研究显示，HIV的gag和nef基因均可以通过RNAi进行沉默，RNAi方法治疗艾滋病已经成为艾滋病治疗研究的热点，研究显示通过RNAi方法可以阻止HIV感染及抑制HIV复制。但其技术本身仍存siRNA稳定性差、容易降解、无靶向性等问题。以重组病毒载体方式导入的siRNA虽然稳定性较高，但是又带来导入效率及载体基因整合等问题。人间充质干细胞(Human Mesenchymal Stem Cells, hMSC)具有多向分化潜能，自身免疫原性低，取材方便。目前美国FDA已经批准其用于自身免疫疾病及基因治疗载体等多个方面的临床试验。
技术实现思路
本专利技术的目的是筛选出针对HIV-I非结构基因vpr，tat, vif, rev具有基因沉默作用的siRNAs序列，并将这些siRNAs序列构建到慢病毒载体，在干细胞及其他传代细胞中进行表达，制备一种含有对HIV特异性沉默的SiRNA的生物颗粒，以用于制备预防和治疗艾滋病的药物。本专利技术提供了一种靶向Hiv-I特异性SiRNA慢病毒为载体间充质干细胞内表达的siRNA生物纳米粒，经体外HIV活病毒攻击实验证实，可用于艾滋病毒的感染者和艾滋病患者的治疗。本专利技术有如下创新点其一，本专利技术首次发现了可使HIV-I非结构基因vpr，tat, vif, rev基因沉默的6个siRNAs序列本专利技术人针对HIV-I病毒基因组的vpr, tat, rev, vif基因的保守区域设计了 14条干扰RNA序列，经实验筛选，发现其中以下6条siRNA序列可以特异地靶向HIV-lvpr， tat, vif,rev 靶向siRXAs序列名称卬列兮序列vprVpr—sh4SEQ ID MO: I gagtgaagc t gt tagacattatTat-1x4SEQ II) NO;2 gtgttgctttcattgccaaTal、rev tat and rev-1x6 SEQ ID NO:3 gacicaicaagcticiciarevrev-Ixl ISKQ ID XO:4 ggtggaatctcctacagta￥ifvilMSEQ ID NO:5 tatcaagcaggacataacaVifVif-2SEQ ID NO:6 agagactggcatttgggtc其二，本专利技术构建了含有HIV env基因的重组慢病毒载体，筛选到能够稳定表达HIV跨膜蛋白gpl20和gp41的hMSC-env细胞系。该细胞系的名称为XXXX，已于年月日保藏于XXXX，保藏号为XXXX所述细胞系可用于制备siRNA的生物纳米粒。由于gpl20蛋白对⑶4分子具有亲和性，使制备的siRNA生物纳米粒具有靶向性。其三，本专利技术制备了一种含有HIV特异性siRNA的间充质干细胞生物纳米粒该生物纳米粒载有上述靶向HIV-I特异性siRNA，所述siRNA的序列如上表所示的SEQID NO:I SEQ ID NO:6。该生物纳米粒还具有以下特征I)大小在 10_500nm 之间；2)具有人间充质干细胞(Human Mesenchymal Stem Cells, hMSC)外膜；3)镶嵌病毒的膜蛋白gpl20。本专利技术在人CD4+T淋巴细胞和人造血干细胞(Human Hematopoietic StemCell, hHSC)中检测了获得的生物纳米粒对HIV活病毒的抑制效率。经此实验证实，该生物纳米粒可作为药物直接用于治疗和预防艾滋病。其五，本专利技术提供了上述含有HIV特异性siRNA的间充质干细胞生物纳米粒的制备方法方法是将含有上述siRNA序列(I 6个)的双链DNA构建到永久性表达目的基因的重组慢病毒载体中，在293T细胞中包装出重组慢病毒；用收获的重组病毒感染hMSC，加入嘌呤霉素筛选出表达siRNA的hMSC细胞系，经筛选表达siRNA的hMSC细胞系可以持续高效的表达siRNA ;体外连续收获细胞培养液，超速离心浓缩，获得含有siRNA的生物纳米粒。本专利技术的优点和效果本专利技术结合siRNA的高效性和hMSC的低免疫原性，在提高siRNA的稳定性的同时避免载体整合带来的安全性问题。具体而言，选用针对HIV特异性的siRNA，以携带特异性的siRNA重组慢病毒将其导入到永生化的间充质细胞中，在细胞内转录复制，以吐胞的形式将带有永生化间充质细胞膜的siRNA生物纳米粒分泌到细胞外，经过浓缩纯化后，用于HIV-I的基因治疗。本专利技术方法提供的含有HIV特异性siRNA的生物颗粒具有以下优点 I、提高了稳定性利用生物膜包被的方式提高了 siRNA的稳定性；2、提高了安全性，适用范围广本方法与现有技术的病毒载体导入方式相比又大大提高了安全性。其中间充质干细胞制备的颗粒具有较为广泛的组织亲和性，同时免疫原性较低，从而本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生物纳米粒，含有靶向HIV？1特异性siRNA，所述siRNA选自SEQ？ID？NO:1～SEQ？ID？NO:6所示序列的1～6种。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：滕智平，马晶，郝彦哲，杨怡姝，孙晓梅，曾毅，
申请(专利权)人：曾毅，滕智平，杨怡姝，
类型：发明
国别省市：
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