本发明专利技术为一种Klotho腺相关病毒在制备治疗SHR大鼠高血压心脏病药物中的应用。通过实验研究结果显示，通过Klotho基因转导可以控制SHR大鼠血压进一步升高，减轻高血压心脏病心脏损害即可以保护SHR大鼠心脏，至少可以持续12周，Klotho腺相关病毒完全可以作为制备治疗SHR大鼠高血压心脏病药物对高血压及相关心血管疾病进行治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体的说，涉及一种Klotho腺相关病毒的新用途。
技术介绍
研究表明高血压病及其相关的心血管疾病已成为危及人群健康的常见病；而老年人因罹患心血管病而致的死亡明显高于年轻人。因此，高血压病以及相关心血管并发症与衰老密切相关，也是影响其预后的重要因素。已有研究证实自发性高血压(spontaneoushypertensive rat, SHR)大鼠具有许多人类自发性高血压的特征,是一种很好的高血压模型动物，其血压水平有随年龄增长而增高的特点，常伴发心、肾及血管等靶器官损伤，其中高血压心脏病以心肌肥大、心肌纤维化、心室重塑等损害更为重要。 Klotho基因作为一种于1997年被KuiX)等人发现的新型衰老相关基因，其研究发现在Klotho基因敲除小鼠模型上Klotho可以抑制多种类似人类衰老相关表型，如动脉硬化、骨质疏松、生殖功能减退、肺气肿、寿命缩短等。而Klotho的过表达可以延长寿命。研究发现Klotho基因可以抑制胰岛素IGF-I信号通路，增加NO活性，调节离子通道活性。Klotho还可以对抗内皮功能障碍。肖明能等研究报道40岁以后血浆Klotho蛋白水平随年龄增加而有下降趋势。Wang等报道Klotho在体内的基因转导可以阻止高血压的进程和保护肾脏功能。但就Klotho在心脏靶器官损伤中是否也发挥了作用，以及是否对高血压心脏病有治疗作用，目前尚未见报道。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术的目的在于提供一种Klotho腺相关病毒作为制备治疗SHR大鼠高血压心脏病药物的新用途。本专利技术目的是这样实现的=Klotho腺相关病毒在制备治疗SHR大鼠高血压心脏病药物中的应用。动物实验I.材料I. I实验动物10周龄雄性SHR大鼠购自北京维通利华实验动物公司，10周龄雄性SD大鼠购自重庆医科大学实验动物中心。I. 2 试剂多克隆兔来源IGF-I、IGF-1R、p-Akt (Ser473)、t-Akt—抗购自北京博奥森生物公司；IGF-U Rat Insulin ELISA kit为R&D公司分装产品；RIPA蛋白裂解液(浆)、PMSF、SDS-PAGE配胶试剂盒、转膜液、电泳液、蛋白Maker、PVDF膜均为碧云天产品。2.方法2. I动物实验方案实验研究分4组，实验组A、B、C 3组均为SHR大鼠，对照组(D组)为年龄、性别一致的SD大鼠，每组5只。所有大鼠均在重庆医科大学附属第一医院中心实验室动物房SPF级饲养，标准大鼠饲料喂养，饮水中加复合维生素B。自由取食饮水。采用无创尾动脉袖带法测量大鼠静息收缩压。无创尾动脉袖带法是一种常用的血压检测方法。所有大鼠在实验前检测血压、体重。实验组即A、B、C组SHR大鼠分别行尾静脉注射PBS(0. 5ml/只)、rAAV. mKL (3 X IO8Vg/ 只，O. 5ml)和 rAAV. EGFP (3 X IO8Vg/ 只，O. 5ml);对照组 SD 大鼠尾静脉注射PBS 0.5ml作为对照研究。随后每两周测体重、血压一次，连续观察12周。实验结束时处死全部大鼠。处死前用水合氯醛腹腔注射麻醉，采血分离血浆。分离心脏，去除血液、大血管称重。取部分左心室用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片做HE、MaSSon染色；部分OCT包埋，做冰冻切片，荧光显微镜观察荧光。2. 2免疫组化检测心脏klotho蛋白表达使用博奥森SP免疫组化染色试剂盒，步骤如下大鼠心脏组织切片脱蜡至水，1%胰酶37°C 25min抗原修复，3 %过氧化氢孵育lOmin，封闭液37°C封闭25min，4°C孵育一抗 (Anti-Klotho,l 50)过夜，I 100 二抗37°C孵育30min，HRP标记链霉卵白素工作液孵育30min，DAB显色l-5min。复染、脱水、透明、封片、晾干。Leica正置显微镜观察、采图，Image-Pro Plus 6. O 软件分析阳性异染颗粒 IOD (Integrated Optical Density)值。2. 3 心脏 HE 及 Masson 染色各组大鼠心脏组织切片，常规HEQiematoxylin)染色观察心肌细胞，同时进行Masson三色法胶原纤维染色，Leica正置显微镜观察并采图。2. 4RT-PCR法检测心脏小鼠Klotho mRNA表达用RNAiso Plus按说明书提取心脏总RNA，Nanodrop2000微量分光光度计检测总RNA浓度计A260/A280比值。总RNA浓度在3-5 μ g/μ L，Α260/Α280比值在I. 8-2. O之间，无明显降解及蛋白污染，满足逆转录需要。取I μ g总RNA,用PrimeScriptRT reagent Kit按说明书20 μ L体系逆转录，逆转录所得cDNA-20°C保存。根据NCBI GenBank收录mRNA蛋白编码区序列设计引物。小鼠Klotho (NCBI Reference Sequence NM_013823. 2):上游5，-GGG TCA CTG GGTCAA TCT-3，;下游 5’ -GCA AAG TAG CCA CAA AGG-3，，PCR 产物长度为 710bp。取 2μ L逆转录所得 cDNA，用 Premix Taq Version 2. OPCR 扩增小鼠 Klotho 基因。小鼠Klotho PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳观察分析。β-actin PCR产物长度为157bp。2.5GFP蛋白检测新鲜心脏组织用OCT包埋，冰冻切片(20 μ m)。用Leica DM6000荧光正置显微镜观察绿色荧光表达情况，并采图。2. OTestern blot 检测 Klotho 蛋白表达取新鲜心脏组织约lOOmg，尽量剪碎，加400 μ L RIPA蛋白裂解液(含4 μ L ImMPMSF)冰上充分裂解30min，14，000g 4°C离心5min。收集上清，取IyL BCA法测蛋白浓度。另取20(^1^加同体积蛋白上样缓冲液，沸水煮511^11，-201保存备用。配制8% SDS-PAGE分离胶，每孔加总蛋白40 μ g，蛋白电泳分离，根据蛋白Maker切胶，转至PVDF膜。在含5 % BSA的TBST中37°C封闭lh。I : 750稀释的Klotho—抗4°C孵育过夜。GAPDH—抗I : 1000稀释后孵育。次日HRP标记二抗(I 3000) 37°C孵育Ihour。加ECL后X胶片曝光、显影、定影。Quantity One软件测定蛋白条带灰度值。Klotho蛋白条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值为Klotho蛋白相对表达量。2. 7心脏体重指数大鼠处死前称体重，处死后分离心脏，去除血液、大血管后称重。心脏左心室体重指数=大鼠心脏左心室重量(g) XlOOO+大鼠体重(g)。2. 8数据分析所有数据应用PASW 18软件分析。体重、血压数据应用one-way ANOV A分析，其余数据应用two-ways ANOVA分析,其显著性检验设置为95%可信区间，P < O. 05即为显著性。3.结果3. IKlotho基因转导对SHR大鼠血压的影响在rAAV转导前，17周龄的SHR大鼠基础血压明显高于1本文档来自技高网...
【技术保护点】
Klotho腺相关病毒在制备治疗SHR大鼠高血压心脏病药物中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马厚勋，李宝善，王艳娇，吴平，邓明洪，罗玉梅，李运奎，周婷，杨秋晨，邓小琴，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
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