含有RNA配体的纳米颗粒制造技术

提供了制备具有核心的纳米颗粒的材料和方法，核心包括金属和/或半导体原子，该核心与多个包含RNA配体的配体共价连接。RNA配体可包括siRNA或miRNA。还提供了这些纳米颗粒在治疗和诊断中的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及纳米颗粒，更具体地涉及含有RNA配体如小干扰RNA (siRNA)和微RNA(miRNA)的纳米颗粒，及其在各种应用中的用途。
技术介绍
已经发现小RNA分子在调节基因表达中起着多种作用。这些作用包括小干扰RNA(siRNA)对mRNA的定向降解，转录后基因沉默(PTG)，微RNA (miRNA)对mRNA的发育可控型序列特异性翻译抑制作用和定向转录基因沉默。RNA i活性限制了转座子转移并提供了抗病毒防御(Pal-Bhadra等，2004)。也已经证明了 RNAi机构和小RNA在异染色质复合 物的寻靶以及特定染色体位点上的外遗传基因沉默中的作用(Verdel等，2004)。双链RNA(dsRNA)依赖性转录后沉默，也称为小抑制RNA (siRNA)或RNA干扰(RNAi)，是其中dsRNA复合物可以靶向准特异性的同源基因以在短时间段内沉默的现象。它作为促进具有序列同一性的mRNA降解的信号。20-nt siRNA通常足够长以诱导基因特异性沉默，而且足够短以避开宿主应答(Elbashir等，2001)。定向基因产物表达的降低可以是大范围的，具有由几个siRNA分子诱导的90%沉默。由于小分子寡核苷酸的递送可以绕过与基因治疗相关的困难，所以使用siRNA可能具有优于传统基因治疗的优势。迄今为止，基于载体的治疗基因的体内有效递送仍然是成功的基因治疗中的障碍。已经观察到尽管通过siRNA对靶基因的剔除不是永久性的，单独的siRNA转染可以导致亲本以及子代细胞中靶蛋白的抑制延长(Tuschl，2001)。然而，siRNA的递送在本领域中仍然存在问题。WO 02/32404 (Consejo Superior de Investigaciones Scientificas)公开了由金属或半导体原子形成的纳米颗粒，其中包含碳水化合物的配体与纳米颗粒的核心共价连接。这些纳米颗粒用于调节碳水化合物介导的相互作用且是可溶而无毒的。享有GB-A-0313259.4 (Consejo Superior de Investigaciones Scientificas 和 MidatechLimited)优先权的PCT申请公开了具有核心的磁性纳米颗粒，该核心包含钝态的磁性金属原子，核心与配体共价连接。
技术实现思路
泛泛地说，本专利技术涉及具有核心的纳米颗粒，该核心包含金属和/或半导体原子，核心与RNA配体共价连接。RNA配体通常是设计来模拟小干扰RNA( siRNA)和微RNA(miRNA)序列的短RNA序列。纳米颗粒可以用于递送RNA配体并具有广泛的用途，可在体外系统中应用和用于治疗或诊断。例如，本专利技术的纳米颗粒可以用于(I)定向转录基因沉默，(2)定向mRNA降解，(3) mRNA成象，(4)通过使用相同或不同纳米颗粒上的多种RNA配体来抑制各种途径，(5)气雾剂递送，例如至肺，(6)结合mRNA沉默用于靶向siRNA抗性mRNA和(7)用作功能基因组中的工具。在本领域中，根据其来源将短RNA序列称为“短干扰RNA” (siRNA)或“微RNA”(miRNA)。两种类型的序列都可以通过结合互补RNA (nmRNA)和引发mRNA消除(RNAi)或阻止mRNA翻译成蛋白质用于下调基因表达。siRNA通过长双链RNA的加工来产生，且实际上发现时通常是外源的。微干扰RNA (miRNA)是内源编码的小非编码RNA，通过短发夹的加工来产生。siRNA和miRNA都可以抑制带有部分互补靶序列的mRNA的翻译而没有RNA剪切，且可以降解带有完全互补序列的mRNA。RNAi途径还作用于基因组，如描述于Science，301 :1060-1061,2003。与纳米颗粒相连的RNA可以是单链或双链的(双链体)。将miRNA样序列用作配体的情况中，RNA序列可以是发夹，即包括部分互补区，接近它们可以退火形成发夹的末端。纳米颗粒可以任选地包含另外类型的配体，如碳水化合物来形成糖纳米颗粒，和/或多于一种的siRNA。以下将更详细地讨论纳米颗粒及其用途。有利地，siRNA与纳米颗粒的连接可以提供对siRNA的保护使之不受血液、组织培养基中或细胞内存在的核糖核酸外切酶的影 响。因此，第一个方面中，本专利技术提供了含有核心的纳米颗粒，该核心包括金属和/或半导体原子,其中核心与多种配体共价连接且配体包括RNA配体。形成纳米颗粒的siRNA配体可以是单链或双链的(双链体)。然而，为了最佳化RNA介导的靶基因功能下调的有效性，优选的是选择siRNA分子的长度来确保RISC复合物对siRNA的正确识别，所述RISC复合物介导mRNA靶被siRNA的识别且优选体内施用纳米颗粒时，siRNA足够短来降低宿主应答。miRNA配体通常是单链的并具有能够使配体形成发夹的部分互补区。miRNA通常是单链RNA的形式，并认为调节其他基因的表达。miRNA是从DNA转录，但不翻译成蛋白质的RNA基因。编码miRNA基因的DNA序列比miRNA长。该DNA序列包括miRNA序列和近似反向互补体。当该DNA序列转录成单链RNA分子时，miRNA序列及其反向互补体碱基对形成双链RNA节段；总的来说，该RNA的结构称为发夹结构(‘短发夹RNA’或shRNA)。然后Dicer酶从发夹结构中切掉双链区，而释放成熟miRNA。通过在RNA聚合酶III启动子如人Hl或7SK启动子的控制下用编码shRNA序列的DNA构建体转染细胞，可以在细胞内生产shRNA。或者，可以在外部合成shRNA并直接引入细胞中。通常，旨在模拟siRNA和miRNA效果的RNA配体具有10至40个核糖核苷酸(或其合成类似物)，更优选17至30个核糖核苷酸，更优选19至25个核糖核苷酸，最优选21至23个核糖核苷酸。在使用双链siRNA的本专利技术的一些实施方案中，该分子可具有对称的3’突出端，例如，一个或两个(核糖)核苷酸的3’突出端，通常是dTdT的UU3’突出端。在通过shRNA的剪切来产生mi RNA的情况中，shRNA序列优选40至100个碱基长，更优选40至70个碱基长。发夹的茎区优选19至30个碱基对长。茎区可以含有G-U配对来稳定发夹结构。在使用双链RNA的实施方案中，有义和反义链可以退火形成双链体。通过在反应混合物中包含双链体来形成纳米颗粒，在颗粒自动装配的过程中RNA可以连接至核心。根据双链siRNA衍化末端(每条链的四个可能的5’和3’端)的数量，至多四个纳米颗粒可以连接至单个siRNA双链体上，且对于每个双链siRNA,理论上形成至多十五个可能的构建体，这些中的一个具有四个纳米颗粒(每个末端两个)，四个具有一个纳米颗粒，六个具有两个纳米颗粒和四个具有三个纳米颗粒。在使用单链siRNA的情况中，纳米颗粒核心可以连接在siRNA的任一个或两个衍化末端(即，5’或3’端)上，例如，产生三种不同的纳米颗粒。这些纳米颗粒可以以这种形式来使用或该方法可以任选地包括使含有纳米颗粒的siRNA与siRNA的互补链退火,从而在预先形成的纳米颗粒上原位形成双链体的另外的步骤。在miRNA样配体的形成过程中，通常一个或两个纳米颗粒连接在RNA序列的末端上。因此，在另一方面中，本专利技术提供了在此所述纳米颗粒的本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有核心的纳米颗粒在制备用于治疗由基因表达的下调缓解的病症或与基因的超表达相关的病症的药物中的用途，所述核心包括金属和/或半导体原子，其中所述核心与多个配体共价连接，该配体包括（i）至少一个含有碳水化合物基团的配体和（ii）至少一个RNA配体，该RNA配体包括siRNA、shRNA或miRNA分子，其中所述RNA配体靶向并下调所述基因，并且其中所述纳米颗粒用于在缺乏转染剂的情况下给药。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：T·W·拉德迈克，K·古玛，M·马丁洛马斯，S·佩纳德斯，R·欧杰达，A·G·巴雷特斯，
申请(专利权)人：MIDA科技有限公司，
类型：发明
国别省市：