本发明专利技术提供一种监测固相合成多肽反应终点的检测溶液，由水合茚三酮、铁氰化钾和苯甲酸的溶液组成，溶液的溶剂为水、乙醇、或水和乙醇的混合溶剂。该检测溶液应用在检测树脂上的游离氨基时，比传统的Kaiser检测溶液具有更高的灵敏度和准确度。该检测溶液避免使用剧毒的氰化钾和具有恶臭味的吡啶。在固相法合成抗凝药物比伐芦定的缩合反应中，应用本发明专利技术检测反应终点可以明显提高合成收率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种监测固相合成多肽反应终点的检测溶液及其用于固相合成多肽反应终点的检测方法，尤其是固相合成多肽药物比伐芦定的反应终点的检测。
技术介绍
比伐芦定(Bivalirudin)是一种人工合成的由20个氨基酸组成的多肽,其氨基酸序列为 D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-ΟΗ,化学名称为D_苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-天冬酰胺酰-甘氨酰-天冬氨酰-L-苯丙氨酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L-异亮氨酰-L-脯氨酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸，分·子式C98H138N24O33, CAS号128270-60-0。它是水蛭素的衍生物，具有抑制凝血酶的活性。比伐芦定最早由Biogen公司研发,后由美国The Medicines Company公司开发作为经皮冠状动脉成形术(PCl)中的抗凝剂,美国上市产品商品名为Angiomax 。美国专利US5196404 和中国专利申请 CN200580043573. I、CN200610024611. 5、CN200810008131. 9、CN200910051311. X分别报道了利用固相多肽合成法制备比伐芦定的技术。在固相合成法制备比伐芦定过程中，每一步各氨基酸缩合反应的完全转化对收率有重要的影响。因为多步的串联反应中，每步收率的微小下降会导致最终收率的大幅下降。但如果在反应终点后继续延长反应时间，有可能导致消旋等副反应的增加，同样影响最终的收率。因此，监控和判断缩合反应的终点是固相合成比伐芦定以及其他氨基酸较多的多妝的关键之一。在判断固相多肽合成的缩合反应终点时，使用最广的是Kaiser检测溶液测试法(王德心编，化学工业出版社，《固相有机合成原理及应用指南》，第三章第五节，2004年9月出版；田少雷等，多肽固相合成中茚三酮定量监测法的改进，化学通报，1991年04期，38-39 ;E. Kaiser等，Color test for detection of free terminal amino groups in thesolid-phase synthesis of peptides, Anal. Biochem. 1970, 34, 595-598)。水合却三丽可与游离氨基发生一系列反应，生成有颜色的化合物。该方法灵敏度较高，大多数情况下仅凭肉眼观察，就可以达到定量判断缩合反应终点的效果。在利用显色反应检测氨基的文献中，实际上常使用的是水合茚三酮(ninhydrin)。在强化脱水的条件下，水合茚三酮可以转化为茚三酮(1,2,3-indantrione)。本专利技术所使用的化合物均是水合却三酮(ninhydrin)。0^°O^o0: OO却三酮(I,2,3-indantrione) 水合却三酮(ninhydrin)经典的Kaiser检测溶液包括以下三种溶液(1)5克水合茚三酮与IOOmL乙醇的混合溶液；⑵80克苯酚与20mL乙醇的混合溶液；(3) 2mL O. 001mol/L氰化钾的水溶液与98mL吡啶的混合溶液。使用时各取三种溶液2至3滴溶液，与待测样品混合，在100至120°C之间加热约5分钟。不存在游离氨基时，样品保持原来的颜色，如果存在很少量的游离氨基，大部分氨基酸会出现明显的蓝色，少数氨基酸呈现其他颜色，凭肉眼即可观察。上述的茚三酮检测试剂，根据文献报道其作用机理为，氰化钾提供的氰离子作为还原剂，催化有色物质的生成(Hyman Rosen,Archives of Biochemistry and Biophysics,1957, Volume 67, Issue I, Pages 10-15 ；ffalter Troll 等，The Journal of BiologicalChemistry,1953, Volume 200，Issue 2，Pages 803-811)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种监测固相合成多肽反应终点的检测溶液，由水合茚三酮、铁氰化钾和苯甲酸的溶液组成。当用于监测固相合成多肽的反应终点时，其检测游离氨基的灵敏度和准确度高于传统Kaiser检测溶液(由水合茚三酮、苯酚、氰化钾和吡啶组成)，更易于判断各氨基酸在缩合反应中的完全转化，对提高固相合成多肽的收率具有显著的作用。本专利技术的一种监测固相合成多肽反应终点的检测溶液，由水合茚三酮、铁氰化钾和苯甲酸的溶液组成。上述溶液的溶剂为乙醇、水、或水和乙醇的混合溶剂，优选水和乙醇的混合溶剂。上述检测溶液中，水合茚三酮的浓度为0. 5% 10% (w/v, g/mL)，即ImL溶剂中含有0. 005g 0. Ig的水合茚三酮；铁氰化钾的浓度为0. 1% 2% (w/v, g/mL)，即ImL溶剂中含有0. OOlg 0. 02g的铁氰化钾；苯甲酸的浓度为0.001% 1% (w/v，g/mL)，即ImL溶剂中含有lX10_5g lX10_2g的苯甲酸。上述检测溶液中，水合茚三酮的浓度优选为4% 5% (w/v, g/mL)，即ImL溶剂中含有0. 04g 0. 05g的水合茚三酮。上述检测溶液中，铁氰化钾的浓度优选为0. 4% 0. 5% (w/v, g/mL)，即ImL溶剂中含有0. 004g 0. 005g的铁氰化钾。上述检测溶液中，苯甲酸的浓度优选为0. 01% 0. 1% (w/v, g/mL),即ImL溶剂中含有IX 10' 1X10、的苯甲酸。一种上述检测溶液的制备方法将一定重量的水合茚三酮溶于一定体积的溶剂中，制得溶液A ;将一定重量的铁氰化钾溶于一定体积的溶剂中，制得溶液B ;将一定重量苯甲酸溶于一定体积的溶剂中，制得溶液C ;取一定体积溶液A、溶液B和溶液C混合均匀，得到上述浓度的检测溶液；其中，溶液A和溶液C的溶剂优选为乙醇，溶液B的溶剂优选为水，所得检测溶液的溶剂优选为水和乙醇的混合溶剂。其中，水合茚三酮，英文名Ninhydrin，分子式=C9H6O4, CAS号为485_47_2 ；铁氰化钾，英文名Potassium Ferricyanide，分子式=C6FeK3N6，其 CAS 号为 13746-66-2 ;苯甲酸，英文名Benzoic Acid，分子式=C7H6O2，其 CAS 号为 65-85-0。w/v是指溶质的重量(W)与溶剂的体积(V)之比，其中w的单位为“克”，简写为“g”;v的单位为“毫升”，简写为“mL”;如浓度为1% (w/v)的溶液，是指Ig溶质溶解于IOOmL的溶剂中形成的溶液，本专利技术的溶质包含水合茚三酮、铁氰化钾和苯甲酸等，溶剂包含乙醇、水、或水和乙醇的混合溶剂等。固相合成多肽是指将单个氨基酸或者多个氨基酸组成的多肽片段连在固相载体上，通过化学合成的方法，进行氨基酸缩合反应，以最终得到目标多肽的方法，所述的固相载体通常是指各种树脂，如Wang树脂等。本专利技术的检测溶液用于氨基酸缩合反应中，判断树脂上各氨基酸在合成多肽或多肽片段过程中 的缩合反应是否进行完全。一种监测固相合成多肽反应终点的检测方法取少量载有多肽的树脂到容本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种监测固相合成多肽反应终点的检测溶液，其特征在于，由水合茚三酮、铁氰化钾和苯甲酸的溶液组成，溶液的溶剂为乙醇、水、或水和乙醇的混合溶剂。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谭端明，田茂奎，
申请(专利权)人：深圳信立泰药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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