用于检测水产动物病毒的检测试剂制造技术

本发明专利技术提供一种检测水产动物病毒的检测试剂，该检测试剂可透过磁性免疫分析仪检测带有水产动物病毒抗体的磁性纳米粒子的免疫磁减量(Immunomagnetic?Reduction，IMR)讯号，并通过逻辑函数计算出水产动物体内的病毒浓度，进一步确认水产动物感染病毒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测水产动物病毒的检测试剂套组。
技术介绍
在亚洲及欧洲国家中，石斑鱼是鱼类中重要的品种，其可产生高经济价值。然而，因幼体会遭受病毒的伤害，使幼体的繁殖比例相当低。有多种病毒会攻击石斑鱼，如神经坏死病毒NNV (nervous necrosis virus)、虹彩病毒(irido virus)和感染性膜脏坏死病毒(infection pancreatic necrosis virus)。而神经坏死病毒对于石斑鱼幼体会造成伤害，并且导致死亡率高于90%以上。神经坏死病毒NNV是一种核酸病毒，属于野田病毒中的β -野田病毒(beranodavirus)的一种。神经坏死病毒的大小约为25-30纳米,其包含两种核糖核酸(RNA) =RNAl及RNA2，其中RNAl可表现蛋白质A，而RNA2可表现蛋白质α，形成NNV的帽结构。常见用于定量检测NNV的步骤是包含从石斑鱼组织中萃取出NNV的微颗粒，并进行RNA反转录为DNA，最后利用实时定量聚合酶连锁反应，亦是实时聚合酶连锁反应。虽然上述的方法在检测NNV可表现出高灵敏度及专一性，但因在操作流程中需小心处理，所以仅可适用于在实验室中的熟练该技术的人员操作，此缺点严重地阻碍了检测NNV方法的普及性，并且在水产养殖业中，NNV的大范围检验很难由实时聚合酶连锁反应完成。近年来，有许多研究团队使用酶联免疫吸附分析(ELISA)，如三明治免疫分析技术，而上述技术常因检测时的操作复杂度，无法将该技术普遍地推广。因此，具有容易操作的优点、高信赖性、高灵敏度和专一性的替代技术是近年来逐渐发展的重点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测水产动物病毒的检测试剂套组。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为一种用于检测水产动物病毒的检测试剂，包括多个磁性纳米粒子,分布于水溶液中，其中这些多个磁性纳米粒子中的磁性纳米粒子的构造为磁性核、界面活性剂层，所述界面活性剂层披覆于所述磁性核上，以及多个水产动物病毒抗体，所述多个水产动物病毒抗体结合于所述界面活性剂层上。本专利技术所述的磁性纳米粒子，其材料选自于四氧化三铁(Fe3O4)、三氧化二铁(Fe2O3)、铁猛酸(MnFe2O4)、铁酸钴(CoFe2O4)及铁酸镍(NiFe2O4)所组成的群组。在较佳的实施例中,所述磁性纳米粒子的磁性核的材料为四氧化三铁(Fe3O4)。本专利技术所述的界面活性剂是指能使目标溶液表面张力显著下降的物质，以及降低两种液体之间表面张力的物质，一般的界面活性剂为具有亲水与疏水基团的有机两性物质，可溶于有机溶液和水溶液。在本专利技术中，所使用的界面活性剂材料包含但不限于有机酸、蛋白质Α、蛋白质G、葡聚糖(Dextran)或微脂粒。优选地，所述界面活性剂的材料为葡聚糖。本专利技术中，所述的水产动物病毒包含神经坏死病毒、虹彩病毒和感染性胰脏坏死病毒。优选地，所述水产动物病毒是神经坏死病毒。此外，本专利技术所使用的水产动物指石斑鱼。本专利技术另提供一种检测水产动物病毒的方法，包括提供本专利技术所述的检测水产动物病毒的试剂，并萃取水产动物内的病毒，进一步将试剂与萃取物混合，量测免疫磁减量讯号，并藉由下述逻辑函数定量该病毒的浓度。imi%) - a^b + B, …、 I — Γ其中，A为噪音强度，B为饱和值参数，是神经坏死病毒浓度，Φ。是随着变化的参数，Y是密合参数。 本专利技术还提供一种萃取组织内病毒的方法，其步骤为(I)取出水产动物的脑组织；(2)在含有水产动物脑组织的容器中加入萃取溶液；(3)将含有组织的容器放在冰上，并磨碎该组织；(4)取出容器中的上清液进行检测萃取效率。附图说明图1-1为从石斑鱼幼体萃取神经坏死病毒颗粒的流程图。图1-2为从石斑鱼幼体萃取虹彩病毒颗粒的流程图。图2-1为神经坏死病毒浓度与萃取效率之间的关系示意图。图2-2为虹彩病毒浓度与萃取效率之间的关系示意图。图3-1为表面接有神经坏死病毒抗体(Anti-NNV)的磁性纳米粒子与附有FITC的二级抗体的示意图。图3-2为表面接有虹彩病毒抗体(Anti-GIV)的磁性纳米粒子与附有FITC的二级抗体的示意图。图4为图3所示表面接有神经坏死病毒抗体(Anti-NNV)的磁性纳米粒子与附有FITC的二级抗体在荧光显微镜下观察到受磁铁吸引的一种移动行为。图5为图3所示表面接有神经坏死病毒抗体(Anti-NNV)的磁性纳米粒子与附有FITC的二级抗体在荧光显微镜下观察到受磁铁吸引的另一种移动行为。图6-1为接有神经坏死病毒抗体的磁性粒子的粒径分布图。图6-2为接有虹彩病毒抗体的磁性粒子的粒径分布图。图7为磁性试剂的交流磁化率的虚数部分(Imaginary Part)作为适用的磁场频率函数图。图8为含有虹彩病毒抗体磁性试剂的稳定度测试。图9为免疫磁减量对神经坏死病毒浓度讯号的影响关系图。图10为在实时聚合酶连锁反应的测试方式中，神经坏死病毒浓度与交叉点的关系曲线图。图11为免疫磁减量(MR)与实时聚合酶连锁反应(PCR)检测神经坏死病毒浓度的有效性的关系图。具体实施例方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步描述。实施例1-1萃取石斑鱼幼体中的神经坏死病毒所有神经坏死病毒NNV几乎存在于石斑鱼的脑组织中，本专利技术实施例将取出的O. 5克脑组织放入微量离心管，并加入200 μ I的萃取液(MagQu Co. ,Ltd.)至微量离心管，为了保持组织的新鲜度，将微量离心管放置在冰上并将组织磨碎，磨碎后3分钟，移开在冰上的微量离心管5分钟，取出在微量离心管中含组织的液体的上部溶液，做免疫磁减量检测并量测NNV的浓度。 图1-1是不同石斑鱼脑组织的萃取过程的流程图，其中图1-1 (a)直接从石斑鱼脑组织萃取神经坏死病毒的RNA,所萃取的RNA被转录为DNA,并藉由实时聚合酶连锁反应检测DNA的浓度，即为小亂 。根据萃取的结构，选择700TCID5Q/ml至4X 107TCID5(l/ml的神经坏死病毒浓度作为检测萃取NNV的浓度范围。所述的TCID5tl是指半数组织培养感染量。图1-1 (b)为萃取脑组织的神经坏死病毒颗粒，经由上述萃取流程，在上部溶液中含NNV颗粒通过实时聚合酶连锁反应检测并表示为(tfflV,part。经上述方式所萃取的NNV浓度，可经由ΦΝΝν,_/ΦΝΝν,κΜ的比例获得萃取效率值。如附图2-1所示，700TCID50/ml至4X107TCID50/ml的神经坏死病毒浓度中，本专利技术萃取神经坏死病毒的效率超过80%。实施例1-2萃取石斑鱼幼体中的虹彩病毒(GIV)本专利技术另一具体实施例系萃取石斑鱼幼体中的虹彩病毒(Irido Virus ；GIV)。将取出的O. I克前肾组织放入微量离心管，并加入200 μ I的萃取液(MagQuCo. ,Ltd.)至微量离心管，为了保持组织的新鲜度，将微量离心管放置在冰上并将组织磨碎，磨碎后3分钟，移开在冰上的微量离心管5分钟，取出在微量离心管中含组织的液体的上部溶液，做免疫磁减量检测并量测GIV的浓度。图1-2是不同石斑鱼组织的萃取过程的流程图，其中图l_2(a)直接从石斑鱼前肾组织萃取虹彩病毒的RNA,所萃取的RNA被转录为DNA,并藉由实时聚合酶连锁反应检测DNA的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测水产动物病毒的检测试剂，其特征在于，包含：溶液；及多个磁性纳米粒子，所述多个磁性纳米粒子分布于所述溶液中，所述多个磁性纳米粒子中的各磁性纳米粒子包含：磁性核；界面活性剂层，所述界面活性剂层披覆于所述磁性核上；及多个水产动物病毒抗体，所述多个水产动物病毒抗体结合于所述界面活性剂层上。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨谢乐，
申请(专利权)人：磁量生技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：