本发明专利技术涉及大白菜EST-SSR标记引物及其在品种鉴定中的应用，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术提供大白菜EST-SSR标记引物BRE121的序列及上述标记引物在大白菜品种鉴定中的应用。本发明专利技术所述EST-SSR引物的扩增产物都呈现双亲互补带型，而且带型间大小差异明显，能够很好的区分杂交种和亲本自交系、鉴别不同的品种。对同一品种内的个体间的扩增产物，其带型一致。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及大白菜EST-SSR标记引物及其在品种鉴定中的应用，属于分子生物学
技术介绍
大白菜(Brassica rapa L. ssp. pekinensis)为十字花科芸薹属植物,是我国和东亚国家的重要蔬菜。品种的差异直接影响着大白菜的生产和食用品质，因此大白菜品种鉴别和纯度鉴定工作非常重要。传统的最可靠的种子纯度检测方法是GOT (grow-out test)法，它是通过田间种植，根据形态学特征对杂交种进行鉴定。GOT法的最大缺点是费时费力、容易受环境和主观因素的影响。近年来，同工酶、蛋白质电泳法可以用于蔬菜种子纯度的鉴 定，然而，一些亲缘关系近、来自同一地区的蔬菜品种由于蛋白质电泳的多态性少，往往难以区分。因此，建立一套快速、精确、廉价的蔬菜种子纯度检测技术，显得非常必要。随着现代分子生物学的发展，分子标记越来越多的被应用于种子纯度鉴定中，如以分子杂交为基础的RFLP、以酶切和PCR为基础的AFLP等、以PCR反应为基础的RAPD、SCAR、SSR、ISSR等。与其它分子标记相比，SSR标记具有许多独特的优点。SSR标记在单个座位上能检测到的多态性远高于其它几种分子标记，而且它广泛、随机地分布于整个基因组，具有共显性遗传的特点；SSR标记可以准确高效地鉴别大量等位基因；利用杂交种双亲在一些SSR位点的差异，可以将呈父母本互补带型的杂交种与其双亲、甚至也可以将一些异源花粉造成的杂交种区分开。由于上述特点，SSR标记逐步成为蔬菜作物品种鉴定的理想分子标记之一。迄今为止简单重复序列(Simple sequence repeat, SSR)标记已在多种农作物种子的品种纯度鉴定中得到应用。根据建立SSR标记序列性质不同，SSR标记可分为，基因组SSR (gSSR)和表达序列标签SSR (EST-SSR)0与构建小片段基因组文库进行SSR的筛选建立gSSR标记相比，从EST数据库中获得SSR建立EST-SSR标记要经济得多；而且EST-SSR标记来源于DNA的转录区域，比gSSR标记具有更高的通用性。李新海等利用SSR标记研究了 70份我国主要玉米自交系的遗传变异(参见《中国农业科学》，2003年第36卷第6期，《利用SSR标记划分70份我国玉米自交系的杂种优势群》)；番兴明等利用SSR标记将我国温带玉米主要杂种优势群进行了划分(参见《作物学报》，2003年11月，第29卷第6期，《利用SSR标记对29个热带和温带玉米自交系进行杂种优势群的划分》)；李稳香等用SSR标记对10个杂交水稻组合的子一代种子纯度进行了鉴定(参见《福建农林大学》，2006年，利用SSR标记构建水稻特征指纹及种子纯度分析的研究);彭锁堂等对我国9个主要的杂交水稻组合及其亲本进行了 SSR标记分析(参见《中国水稻科学》，2003年01期，我国主要杂交水稻组合及其亲本SSR标记和纯度鉴定)。陈琢等开发了甘蓝的EST-SSR标记(参见《园艺学报》，2010年02期，甘蓝EST-SSR标记的开发与应用)。李丽和郑晓鹰建立了用于白菜和大白菜品种鉴定的由3个引物对组成的6套EST-SSR复合标记组合(参见《园艺学报》，2009年11期，用于白菜和大白菜品种鉴定的EST-SSR复合标记的建立)。但是有关大白菜EST-SSR引物的开发远未达到饱和。为了提高EST-SSR标记的密度和提高大白菜品种鉴定的效果，有必要开发更多的EST-SSR标记。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供大白菜EST-SSR标记引物及其在品种鉴定中的应用。大白菜EST-SSR标记引物BRE28，它由核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的下游引物组成。大白菜EST-SSR标记引物BRE121，它由核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示的下游引物组成。 大白菜EST-SSR标记引物BRE131，它由核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示的下游引物组成。上述大白菜EST-SSR标记引物BRE28、大白菜EST-SSR标记引物BRE121和/或大白菜EST-SSR标记引物BRE131在大白菜品种鉴定中的应用。上述应用，步骤如下(I)利用改良的CTAB法提取待鉴定样品总DNA ；(2)以步骤(I)提取的待鉴定样品总DNA为模板DNA，引物为大白菜EST-SSR标记引物BRE28、大白菜EST-SSR标记引物BRE121或大白菜EST-SSR标记引物BRE131进行PCR扩增，PCR采用20 μ L反应体系40ng 模板 DNA,I XPCR buffer (含 20mmol · L^1MgCl2),200 μ mol · L 1NTPs, 引物 O. I μ mol · L \IU TaqDNA 聚合酶；PCR扩增条件如下95°C 预变性 5min ;94°C变性 45s，56°C退火 45s，72°C 延伸 lmin，共计 35 个循环；72°C延伸 10min,4°C IOmin 终止反应；(3)将步骤(2) PCR扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显影并与标准样品聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显影的泳带进行对照。所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为6%聚丙烯酰胺凝胶电泳。所述步骤(3)的具体步骤如下将步骤(2) PCR扩增后的产物与上样缓冲液混匀后，取4μ I点样，进行电泳分离，电极缓冲液为IXTBE (Tris-硼酸)，在25°C、2000V恒压下电泳2h，通过银染法显影，将显影后的泳带与标准样电泳后显影的泳带进行对照。上述电泳在Sequi-Gens'iGT核酸电泳系统(Bio-Rad, USA)中进行。上述上样缓冲液为常用缓冲液，也可采用如下成分的缓冲液，配制过程按本领域常用技术98%的去离子甲酰胺，IOmM EDTA (pH8. O)，O. 025% 二甲苯青，O. 025%溴酚兰。改良的CTAB法、银染显影均可按现有技术进行，其他操作如无特别说明均为本领域常用技术。本专利技术的有益效果为了提闻SSR标记的密度和提闻大白菜品种鉴定的效果,本专利技术提供了 3对新的EST-SSR引物，分别被命名为大白菜EST-SSR标记引物BRE28、大白菜EST-SSR标记引物BRE121和大白菜EST-SSR标记引物BRE131，并将它们应用于品种纯度鉴定中。利用3对EST-SSR引物对13个大白菜品种的DNA进行扩增，并利用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染检测。发现这3对EST-SSR引物的扩增产物都呈现双亲互补带型，而且带型间大小差异明显，能够很好的区分杂交种和亲本自交系、鉴别不同的品种。对同一品种内的个体间的扩增产物，其带型一致，3对EST-SSR引物用于品种纯度检测，体现品种内的一致性。附图说明图I是本专利技术涉及的3对EST-SSR标记引物对18个大白菜样品的检测结果；其中泳道I、大白菜691，2、大白菜690，3、大白菜杂交种773，4、大白菜668，5、大白菜663,6、大白菜杂交种761,7、大白菜691,8、大白菜690,9、大白菜杂交种773,10、大白菜夏白I号，11、大白菜夏白45,12、大白菜夏优本文档来自技高网...
【技术保护点】
大白菜EST？SSR标记引物BRE121，它由核苷酸序列如SEQ？ID？NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ？ID？NO.4所示的下游引物组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高建伟，周新成，刘立锋，李利斌，李化银，张庶，
申请(专利权)人：山东省农业科学院蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：
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