本发明专利技术涉及生物技术领域，具体地说是涉及一种病毒抗原含量检测试剂盒及其制备方法，更具体地说是涉及一种对EV71病毒抗原含量进行定性和定量的酶联反应免疫试剂盒及其制备方法。本发明专利技术采用的双抗体酶联反应检测试剂盒及其制备方法具有特异性好、灵敏度高、方便快捷且经济等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体地说是涉及一种病毒抗原含量检测试剂盒及其制备方法，更具体地说是涉及一种对EV71病毒抗原含量进行定性和定量的酶联反应免疫试剂盒及其制备方法。
技术介绍
(一)EV71病毒及其疫苗的研究进展I、概述及致病机制肠道病毒71型(英文名为Human enterovirus 71),简称EV71 :EV71病毒属于小RNA病毒科，病毒颗粒为典型的正二十面体结构。由于EV71引起的手足口病(hand-footand mouth disease ;HFMD)影响范围的广泛性、危害的严重性,该病在中国已纳入丙类传染·病管理。鉴于此，世界各国学者、生物公司正致力于EV71病毒疫苗的研究。EV71病毒属于小RNA病毒科，病毒颗粒为典型的正二十面体结构。其基因组为单股正链RNA,长度约为7，408个核苷酸，编码开放读码框(open-reading frame, 0RF)。EV71基因组编码的多聚蛋白(polyprotein)约含2,193个氨基酸,该多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2、P3三个前体蛋白(图I)。经过进一步的剪切，Pl前体蛋白可以进一步成熟为VP1、VP2、VP3和VP4四个病毒结构蛋白，负责病毒颗粒的装配和稳定；P2前体蛋白则进一步成熟为非结构蛋白(non-structural protein, nsp) 2A(特异性蛋白酶)、2B和2C ;P3前体蛋白则用以形成非结构蛋白3A、3B(VPg，5’末端结合蛋白)、3C(特异性蛋白酶)和3D(RNA-dependent RNApolymerase, RdRp)。肠病毒的流行与季节转换、环境变异有着极大的关联性，肠病毒只在夏季及初秋流行，每年六 九月为高峰期，气温过低的地区并不利于肠病毒生存。根据流行病学调查，肠病毒之传染途径主为粪一口传染(stool-oral)，感染肠病毒的患者会经由粪便排出病毒，这些含有高浓度肠病毒的粪便会污染环境甚至地下水源，在公共卫生条件不佳的地区，极易经由污染的水源而散播该病毒。EV71对于中枢神经系统有极高的感染性，故临床上出现之症状包括脑炎(encephalitis)、无菌性脑膜炎(aseptic meningitis)、急性无力肢体麻痹(acute flaccid paralysis)、手足口症(hand-foot-mouth disease)、泡疫性咽峡炎(herpangina)、急性出血性结膜炎(acute hemorrhagic conjuctivitis)、肌肉僵直(myoclonicjerk)、头痛(headache)、发烧(fever)及呕吐(vomoting)等,而其中以手足口症及泡疹性咽峡炎最为常见。一般而言，感染肠病毒多为无症状(约50 80%)或出现轻微类似感冒的症状，病人会自然痊愈而产生抗体，但因感染肠病毒且转成重症之患者却有极高的机率死于心肺衰竭及广泛性的脑干伤害，实不容小觑。3、流行病学人类肠病毒71型于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的，这些病毒可被培养在恒河猴肾脏细胞(rhesus monkey kidneycell ；RhMK)及人胚二倍体细胞(human fetal diploid cell)中。若检体取自病人粪便及组织即以人胚肾二倍体细胞(diploid strain of human fetal kidney cell ；HFDK)培养；若为咽喉拭子检体则选用人胚肺二倍体细胞(diploid strain of human fetal lungcell)培养。经由这些细胞培养后纯株化病毒分析，发现会出现典型由肠病毒所致的细胞病变(cytopathetic effect ；CPE)现象，由电子显微镜下观察其形态(morphology)及物理化学(physicochemical)特性都与当时已知的其他肠病毒类似,但进行中和抗体试验(neutralization test)或免疫扩散试验(immunodiffusion test)后，却发现其彼此间并不会有交互作用的现象，因此推测当时所发现的病毒为一种新型的肠病毒，故将该病毒株命名为肠病毒71型。手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。1957年新西兰首次报道该病，1958年分离出柯萨奇病毒(Coxsackieviruses), 1959年提出手足口病名称。手足口病的早期病原体主要为Cox A16型，但1969年美国在中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出EV71病毒并被首次确认。此后EV71感染与Cox A16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。 3、产品研发加强对EV71型感染病患的防控工作，已成为我国病毒性传染病管理工作的目标之一。而相关疫苗的研究开发和病毒抗原的快速检测试剂盒是预防控制此传染病的关键。在EV71病毒所编码的四个结构蛋白中，VP1、VP2和VP3主要用来形成包装病毒颗粒的衣壳(capsid)，而VP4则被包埋在病毒衣壳的内部，负责与核心(core)相互作用，用以稳定病毒的基因组，因此VP1、VP2和VP3形成了 EV71病毒的主要抗原决定簇，其中又以VPl的抗原性最强，而成为目前抗体研究与设计开发的主要靶点。同时，研究表明肠道病毒存在着众多的型内、型间的交叉反应性，并且存在着较高的重组性。其中EV71与Cox A16的相似性达到了 80%，拥有很多共同表位，许多克隆抗体EV71的单抗具有了与Cox A16的交叉反应性。成为EV71抗原检测方法建立的一项制约。常规的针对EV71病毒的诊断方法主要通过分离病毒，中和抗体检测和免疫组织化学法来进行。但这些方法费时、费力，无法满足疾病流行期间同时大量处理大量标本的需要。同时，鉴于EV71病毒的危害性,有必要开发一种简单快速易行的检测EV71病毒抗原表位含量的检测方法。该研究使用的特异性识别EV71病毒Vpl中保守区域基因的单克隆抗体具有高效的EV71病毒的中和效果，同时与Cox A16交叉反应性，有效避免了抗原检测中与EV7180%相似性的Cox A16的假阳性干扰。因此，所述方法的成功开发对于疫苗的研发中抗原表位这一有效组分的检测有着重要的意义，同时该方法也为EV71疾病的防治、早期筛查、诊断工作提供了准确、简便、有效的监测手段，具有广泛的应用范围和社会需求。(二)手足口病的研究进展I、概述及发病机制手足口病(Hand-foot-and-mouth disease)是由肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿如果病情发展快，导致死亡。引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，以及肠道病毒71型均为手足口病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV71)最为常见。2、流行病学手足口病是世界性传染病，世界各地均有发生。1957年新西兰首次报道该病，1958年分离出柯萨奇病毒，1959年提出手足口病名称。手足口病的早期病原体主要为Cox A16型，但1969年美国在中枢神经系统疾病的婴儿粪便本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测EV71抗原的酶联反应试剂盒，试剂盒内设有阳性参考品、样品稀释液、浓缩洗液、显色液A、显色液B和终止液，还装有特异性识别EV71病毒Vp1中保守区域基因的单克隆抗体或其保守性突变体或活性片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：史晋，刘昊智，鲍路伟，王文灏，程超，张爱晖，
申请(专利权)人：上海博沃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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