基于黑猩猩68型腺病毒的单克隆抗体及其制备方法和其应用技术

本发明专利技术公开了一种以黑猩猩68型腺病毒六邻体蛋白为抗原免疫小鼠得到分泌抗AdC68的Hexon蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，并对抗体可变区测序得到相应序列，构建至表达载体质粒，获得了稳定高效表达的重组单克隆抗体，将重组抗体用于黑猩猩68型腺病毒的病毒滴定并验证，采用本发明专利技术所得重组单抗检测黑猩猩68型腺病毒的专属性、线性范围、重复性及中间精密度、耐用性均满足要求。耐用性均满足要求。耐用性均满足要求。

【技术实现步骤摘要】
基于黑猩猩68型腺病毒的单克隆抗体及其制备方法和其应用


[0001]本专利技术涉及一种基于黑猩猩68型腺病毒的单克隆抗体及其制备方法和应用，属于重组蛋白领域生物


技术介绍

[0002]复制缺陷型腺病毒因其低毒性、多组织嗜好性、异源基因表达水平高、诱发的免疫反应强、易于制备生产等特性，已被广泛应用于基因治疗药物载体及疫苗载体。其中，以人5型腺病毒为代表的的传统腺病毒载体，因存在着在人群中预存免疫比例高等缺陷，临床效果并不理想，故非人类腺病毒血清型载体逐渐成为了人们关注的热点。黑猩猩腺病毒68型是首个文献报道的用于疫苗研发的黑猩猩腺病毒载体，其具备与人5腺病毒相近的免疫原性，在人群中预存抗体比例低，且不被人类腺病毒抗体交叉中和等优势，在疫苗及基因治疗药物研制上应用已日渐增多。常用的腺病毒定量方法有紫外分光光度法检测病毒颗粒数，荧光定量PCR法检测病毒组基因拷贝数，噬斑法或TCID50法测定法检测病毒滴度等。紫外分光光度法方便、快速，但是易受到供试品中基质的影响，仅适用于高度纯化后腺病毒的定量。荧光定量PCR法定量范围广，灵敏度高，供试品核酸提取步骤能够降低或消除供试品基质的干扰，但是同紫外分光光度法一样，无法检测出具备感染性的腺病毒数量[12]。噬斑法或TCID50法通过将腺病毒接种至细胞培养，并观察细胞病变情况来计算感染性腺病毒数量，但试验周期长(通常要10天以上)，试验重复性不佳。
[0003]Hexon蛋白是腺病毒最重要的结构蛋白之一，其拥有由一个高度保守的核心结构，另有7个高变区域，具有种属特异性及血清特异性决定位点，也是血清型特异性中和抗体的主要靶点。
[0004]在基因治疗和疫苗研制过程中，腺病毒载体的滴度是重要的质量控制指标，开发出准确且特异的滴度检测方法对于基因治疗及疫苗研发工艺开发和生产过程监控具有重大意义。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的是以黑猩猩腺病毒68型Hexon蛋白为抗原，制备一种特异识别黑猩猩腺病毒68型的重组单克隆抗体，用于细胞免疫染色法测定黑猩猩腺病毒68型载体的滴度测定，为以黑猩猩68型腺病毒为病毒载体的基因治疗药物及疫苗研制工艺研究提供指导。
[0006]基于上述原因，本专利技术提供一种基于黑猩猩68型腺病毒的单克隆抗体，能够有效检测黑猩猩68型腺病毒的病毒滴度，以解决上述问题。
[0007]为实现上述专利技术目的之一，本专利技术提供一种基于黑猩猩68型腺病毒的单克隆抗体，所述抗体包括重链和轻链，重链和轻链分别包含3个CDR区和4个FR区，其中所述重链的CDR1区的氨基酸序列为GLPFNTKA(SEQ ID NO:1)，所述重链的CDR2区的氨基酸序列为IRTKSNNYAT(SEQ ID NO:2)，所述重链的CDR3区的氨基酸序列为VRDEAS(SEQ ID NO:3)，所
述重链的FR1区的氨基酸序列为EVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCAVS(SEQ ID NO:4)，所述重链的FR2区的氨基酸序列为MDWVRQAPGEGLEWVAR(SEQ ID NO:5)，所述重链的FR3区的氨基酸序列为YYADSVKDRFTISRDDAQSMLYLQMTNLKTEDTAMYYC(SEQ ID NO:6)，所述重链的FR4区的氨基酸序列为WGHGTLVTVSA(SEQ ID NO:7)，所述轻链的CDR1区氨基酸序列为QSLVHSDGNTY(SEQ ID NO:8)，所述轻链的CDR2区氨基酸序列为KVS(SEQ ID NO:9)，所述轻链的CDR3区氨基酸序列为SQSTHFPWT(SEQ ID NO:10)；所述轻链的FR1区的氨基酸序列为DIVMTQIPLSLPVSLGDQASISCRSS(SEQ ID NO:11)，所述轻链的FR2区的氨基酸序列为LHWYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:12)，所述轻链的FR3区的氨基酸序列为NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC(SEQ IDNO:13)，所述轻链的FR4区的氨基酸序列为FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:14)。
[0008]优选地，所述抗体为抗AdC68抗体，且抗体重链的序列为：EVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCAVSGLPFNTKAMDWVRQAPGEGLEWVARIRTKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDAQSMLYLQMTNLKTEDTAMYYCVRDEASWGHGTLVTVSA(SEQ ID NO:15)；
[0009]轻链的序列为：
[0010]DIVMTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHFPWTFGGGTKLEIK(SEQ IDNO:16)。
[0011]优选地，上述黑猩猩68型腺病毒的Hexon蛋白序列为：
[0012]DGETATEKTYTYGNAPVQGINITKDGIQLGTDTDDQPIYADKTYQPEPQVGDAEWH
[0013]DITGTD
[0014]EKYGGRALKPDTKMKPCYGSFAKPTNKEGGQANVKTGTGTTKEYDIDMAFFDNR
[0015]SAAAAGL APEIVLYTENVDLETPDTHIVYKAGTDDSSSSINLG(SEQ ID NO:17)。
[0016]优选地，上述抗体为IgG抗体。
[0017]为实现上述专利技术目的之一，本专利技术采用的制备基于黑猩猩68型腺病毒的单克隆抗体的方法技术方案如下：
[0018]本专利技术提供的方法以黑猩猩68型腺病毒六邻体蛋白为抗原免疫得到杂交瘤细胞，构建至表达载体质粒，获得重组单克隆抗体。
[0019]进一步所述方法，包括如下步骤：
[0020]a)采用黑猩猩68型腺病毒Hexon蛋白质序列，按照大肠杆菌的密码子偏好，合成目的基因插入表达载体pET
‑
32a，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆；
[0021]b)抗原表达和纯化；
[0022]c)动物免疫；
[0023]d)细胞融合及亚克隆筛选出单克隆杂交瘤细胞株；
[0024]e)扩大培养单克隆杂交瘤细胞株并纯化。
[0025]优选的，所述制备方法还包括鉴定步骤，采用单抗亚型试剂盒检测杂交瘤细胞上清的抗体亚型；具体为：将细胞上清分别加入到6个包被有50ng AdC68
‑
Hexon蛋白的酶标板孔中，100μL/孔。37
°
孵育1h，PBST洗板三次，分别将稀释好的抗小鼠IgM，IgA，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3的酶标二抗加入至上述6个孔中，37℃孵育1h，PBST洗板三次，TMB显色。
[0026]更优选地，步骤b抗原表达的具体为：将构建好的质粒转化BL21 DE3感受态细胞，接种抗性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于黑猩猩68型腺病毒的单克隆抗体，其特征在于：所述抗体包括重链和轻链，重链和轻链分别包含3个CDR区和4个FR区，其中所述重链的CDR1区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述重链的CDR2区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述重链的CDR3区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述重链的FR1区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述重链的FR2区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述重链的FR3区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述重链的FR4区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述轻链的CDR1区氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述轻链的CDR2区氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述轻链的CDR3区氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；所述轻链的FR1区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述轻链的FR2区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述轻链的FR3区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述轻链的FR4区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述抗体为抗AdC68抗体，且抗体重链的序列如SEQ ID NO:15所示，轻链的序列如SEQ ID NO:16所...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵萍，吴月，何佩，柯美强，
申请(专利权)人：上海博沃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：