抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体及制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，公开了一种抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体及制备方法和应用。本发明专利技术采用重组质粒pET28b

【技术实现步骤摘要】
抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体及制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体及制备方法和应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)感染引起猪的一种发病率高、致死性强的传染病(张艳艳，陈腾，张静远，等.非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株的构建和免疫保护特性[J].中国兽医学报，2019,39(8):1421
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1427)，对生猪养殖业造成巨大的经济损失。临床大多表现为喜卧、体重减轻、慢性皮肤溃疡、关节炎、间歇性发热或高烧，病情严重者一周内可快速死亡(王功民，田克恭，非洲猪瘟.中国农业出版社，北京，2010:150
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7)。
[0003]ASFV是目前已知唯一一种主要通过虫媒传播的双链DNA病毒，其基因组大小为170
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194kb，编码超过150种蛋白质，包括54种结构蛋白和100多种非结构蛋白，病毒粒子呈正二十面体对结构，从外到内包括囊膜、衣壳、内膜、基质和核心(WangN,ZhaoD,Wang J,et al.Architecture ofAfrican swine fever virus and implications for viral assembly[J].Science(NewYork,N.Y.),2019,366(6465):640
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44)。
[0004]P72蛋白属于病毒的衣壳蛋白，8280个p72衣壳蛋白与60个五邻体蛋白相互组装形成病毒衣壳。其主要是在病毒感染晚期表达，是ASFV正二十面体的主要构成成分。P72基因末端478bp序列在不同毒株间有明显差异，根据这段序列将ASFV划分为24个基因型(I
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XXIV)(HakizimanaJN,Nyabongo L,NtirandekuraJB,et al.Genetic Analysis ofAfrican Swine Fever Virus From the 2018Outbreakin South
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EasternBurundi[J].Frontiers inveterinary science,2020,7(1):578474
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84)，欧洲主要流行基因I型和基因II型，亚洲主要流行基因II型(Malogolovkin A,Burmakina G,Titov I,et al.Comparative analysis of African swine fever virus genotypes and serogroups[J].Emerging infectious diseases,2015,21(2):312
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5)。
[0005]目前尚没有ASFV商品化疫苗上市，ASFV的防控主要依靠严格的生物安全防护措施和抗原抗体快速检测技术(WAN Y,SHI Z,PENG G,et al.Development and application of acolloidal
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gold dual immunochromatography strip for detecting African swine fever virus antibodies[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2022,106(2):799
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810)，因此制备特异性高，针对性强的单克隆抗体，以便快速、简便且准确的检测ASFV具有重要意义。
[0006]专利CN 113150079 A公开了一种真核表达的非洲猪瘟病毒p72抗原及其应用。使用两个辅助蛋白B602L和B438L协同帮助p72蛋白在真核细胞中的表达，使其在表达的过程中更易形成天然病毒抗原所具备的空间结构，保证了制备单克隆抗体的抗原更接近于真实病毒抗原，具有很好的免疫原性和抗原性。并从获得的单克隆抗体中优选出其中两株(5G8和12F6)建立了检测ASFV抗原的双抗体夹心ELISA方法，可快速准确地检测ASFV抗原。该专
利制备的单克隆细胞株建立的夹心Elisa方法主要是用于检测病原体，需要两种抗体，在工作量以及经济成本上都比较高，而且要求抗原一定要拥有两个以上的抗体结合部位才行。
[0007]专利CN 115044612 A公开了一种非洲猪瘟病毒p72蛋白稳定表达细胞系及其构建方法。在将p72蛋白完成序列改造得到重组蛋白后，分别将其克隆至原核表达载体、真核表达载体，分别进行原核表达和真核表达；其中，在原核表达的过程中，能得到稳定表达p72重组蛋白的大肠杆菌以及能得到纯化后的p72重组蛋白；经过真核表达后，能得到稳定表达p72重组蛋白的CHO细胞株。利用该专利技术的构建方法能在2个月内筛选获得表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的CHO细胞株。但该专利只完成了抗原的制备，并没有进行单克隆抗体制备或建立ELISA方法。

技术实现思路

[0008]针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本专利技术的首要目的在于提供一种抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备方法。本专利技术方法主要研究p72蛋白，并制备了抗ASFV p72蛋白的单克隆抗体，具有抗体纯度高、亲和性强且特异性强的优点，为ASFV p72蛋白结构和功能研究提供基础。
[0009]本专利技术的另一目的在于提供一种通过上述方法得到的抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体。
[0010]本专利技术的再一目的在于提供上述抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体在制备ASFV防控及诊断试剂中的应用。
[0011]本专利技术目的通过以下技术方案实现：
[0012]一种抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下制备步骤：
[0013](1)将ASFV的p72基因进行密码子优化后(优化后的序列见SEQ.ID NO：1)合成至pET
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28(+)质粒中，得到重组质粒pET28b
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p72；然后转化至感受态细胞进行表达，纯化后得到p72蛋白；
[0014](2)将纯化后的p72蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠，对免疫后小鼠进行尾静脉采血，采用间接ELISA检测免疫后小鼠血清效价，选择血清抗体效价最高的小鼠进行腹腔注射p72蛋白加强免疫；
[0015](3)取加强免疫后小鼠脾细胞，与sp2/0细胞进行融合，待融合成功的细胞汇合度达到50％以上，采用间接ELISA方法筛选出分泌抗p72抗体的阳性杂交瘤细胞，对阳性杂交瘤细胞株进行亚克隆，得到抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体细胞株。
[0016]进一步地，步骤(1)中所述转化至感受态细胞进行表达的步骤为：将pET28b
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p72转化入Rosetta(DE3)和BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落进行培养，将菌液接种于含卡那霉素抗性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：(1)将ASFV的p72基因进行密码子优化后合成至pET
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28(+)质粒中，得到重组质粒pET28b
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p72；然后转化至感受态细胞进行表达，纯化后得到p72蛋白；(2)将纯化后的p72蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠，对免疫后小鼠进行尾静脉采血，采用间接ELISA检测免疫后小鼠血清效价，选择血清抗体效价最高的小鼠进行腹腔注射p72蛋白加强免疫；(3)取加强免疫后小鼠脾细胞，与sp2/0细胞进行融合，待融合成功的细胞汇合度达到50％以上，采用间接ELISA方法筛选出分泌抗p72抗体的阳性杂交瘤细胞，对阳性杂交瘤细胞株进行亚克隆，得到抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体细胞株。2.根据权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述转化至感受态细胞进行表达的步骤为：将pET28b
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p72转化入Rosetta(DE3)和BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落进行培养，将菌液接种于含卡那霉素抗性的LB培养基中震荡培养至OD600为0.4～0.6时，加入IPTG溶液进行诱导蛋白表达。3.根据权利要求2所述的一种抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述单菌落进行培养的条件为：37℃，200rpm过夜培养；所述将菌液接种于含卡那霉素抗性的LB培养基中震荡培养的条件为：将菌液按1:100比例接种于含卡那霉素抗性的LB培养基中，220rpm，37℃震荡培养；所述加入IPTG溶液进行诱导蛋白表达的条件为：加入终浓度为0.5mMIPTG溶液进行诱导蛋白表达，220rpm，28℃继续培养12h。4.根据权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述纯化的步骤为：收集表达培养后的菌体，加入PBS重悬菌体，超声破碎菌体后离心，取上清蛋白溶液进行柱层析纯化。5.根据权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述免疫小鼠的步骤为：将纯化后的p72蛋白以50μg/只与弗氏完全佐剂按1:1等体积乳化...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈桂娥，冯夏宁，陈瑞爱，容芳，孙荣航，李作生，刘郁夫，
申请(专利权)人：肇庆大华农生物药品有限公司华农肇庆生物产业技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：