一种重组蛋白生物制品中有害残留物的检测方法技术

本发明专利技术公开一种重组蛋白生物制品中有害残留物的检测方法，通过反相高效液相色谱法进行检测，分别通过对检测波长，流动相，流动相比例，柱温和进样量进行筛选，对

【技术实现步骤摘要】
一种重组蛋白生物制品中有害残留物的检测方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种重组蛋白生物制品中有害残留物的高效检测方法
。

技术介绍

[0002]二硫苏糖醇
(DTT
，
DL
‑
Dithiothreitol)
化学式为
C4H
10
O2S2，为常用小分子有机还原剂，有抗氧化作用，是一种很强的还原剂
。DTT
通常用于防止二硫键的氧化，可以作为生物学实验中的抗氧化剂，也应用于重组蛋白的提取纯化
。DTT
的危险品代码标志是
Xn(
有害
)
，有刺鼻的臭味，可因吸入
、
咽下
、
皮肤接触而危害健康
。DTT
属于巯基化合物，是强还原化合物，在体内可能会破坏蛋白质的结构，引起酶失活
。
同时
DTT
还可强化含砷和汞的化合物毒性，为确保生物制品的安全性，
DTT
残留是一种关键的质量控制指标
。
然而
DTT
极易被氧化，被氧化后变为包含二硫键的六元环状结构，即氧化型二硫苏糖醇
(DTTox
，反式
‑
1,2
‑
二噻烷
‑
4,5
‑
二醇，
trans
‑
1,2
‑
Dithiane
‑<br/>4,5
‑
diol)
，
DTTox
会使肌酸激酶结构发生变化，达到一定浓度时甚至会使肌酸激酶完全失活
。
因此必须测定
DTT
和
DTTox
的残留量，现有技术的处理方式包括分别对两种物质进行检测以及对样品进行预处理，先采用氧化剂将
DTT
全部氧化成
DTTox
之后再进行检测
。
从生产过程的角度，这些方法存在检测效率低
、
原料浪费的问题
。
此外，出于生产工艺优化和保证生物制品安全性的需要，有必要对
DTT
和
DTTox
的含量进行定量区分
。
罗宁等在“高效液相色谱法测定药品中的二硫苏糖醇和氧化型二硫苏糖醇”中报道了采用
Waters X
‑
Bridge C18
柱，能同时检出
DTT
和
DTTox
，但流动相为体积比为
30:70
的甲醇－水
(
含
0.02
％三氟乙酸
)
，检测波长为
210nm
，不添加三氟乙酸时，会出现拖尾现象，拖尾会降低色谱峰的峰高，使得色谱峰斜率降低，终点不明显，导致积分出的峰面积不准确，使检测限和定量限偏高
。
对于重组蛋白制品来说，三氟乙酸会造成柱效损伤和样品结构改变，影响后续试验
。
[0003]异丙基硫代半乳糖苷
(IPTG
，
Isopropyl
β
‑
D
‑
Thiogalactoside)
化学式为
C9H
18
O5S
，是异乳糖模拟物，能够引起乳糖操纵子的转录过程，因此能够诱导乳糖操纵子下游基因对应蛋白的表达
。
因其不被细菌代谢而十分稳定，普遍应用于原核表达系统，增加重组蛋白表达量提高生物制品稳定性
。IPTG
的危险品代码标志是
Xn(
有害
)
，长期暴露能够引起人体皮肤干裂
。
在罕见的情况下，它可以引起肿瘤发生
。
王荔等报道了重组人生长激素中的
IPTG
的高效液相色谱
‑
脉冲电化学检测方法，但存在脉冲电化学检测器普及程度低，容易被复杂基质干扰等问题
(
王荔
,
林碧蓉
.
反相高效液相色谱
‑
脉冲电化学检测法测定重组人生长激素中异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷
[J].
色谱
,2017,35(3):308
‑
313.)。IPTG
作为一种半乳糖结构类似物，有类似单糖的化学结构
。
由于
IPTG
的极性较强，现有的高效液相色谱法检测
IPTG
的流动相主要采用极性较强的甲醇溶液，检测波长为
230nm。
金磊等报道了高效液相色谱
‑
串联质谱法测定重组胰岛素中的
IPTG
，同时发现使用高效液相色谱分离
IPTG
时，常用的乙腈作为流动相色谱峰有明显的拖尾，将乙腈替换为极性稍大的甲醇后，色谱峰形对称性好
。
杨斌在“异丙基
‑0‑
D
‑
硫代毗喃半乳糖甘溶液的稳定性研究”中报道了色谱柱选用
C18
，流动相
为
10
％甲醇溶液时，定量限为
mg/mL
级别，若更换流动相为乙腈溶液，定量限还要升高
(
金磊
,
王鹏
,
胡骏杰
,
刘飞
,
曹婧
.
高效液相色谱
‑
串联质谱法测定重组胰岛素中的异丙基硫代半乳糖苷
[J/OL].
分析试验
)。
[0004]综上，
IPTG
和
DTT
在大肠杆菌生产重组蛋白生物制品经常一起使用，
IPTG
用于提高重组蛋白的表达量，
DTT
用于从包涵体中提取出重组蛋白生物制品后的溶解和复性，所以同时检测
IPTG
，
DTT
，
DTTox
在生物制品中的含量是非常有必要的
。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的之一是提供一种具备通用性及高性价比，且高效的用于重组蛋白生物制品的有害残留物的检测方法，该检测方法是通过反向高效液相色谱法进行检测，色谱条件为：
[0006]色谱柱：单官能团硅烷键合相硅胶填料；
[0007]检测波长：
201nm
～
215nm
；
[0008]流动相：体积比5％～
10
％的乙腈水溶液，等度洗脱
。
采用乙腈作为流动相，相对于极性更高的甲醇检测波长更小，紫外吸收更强，检测限定量限更低，可以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种重组蛋白生物制品中有害残留物的检测方法，其特征在于，所述检测方法是通过反向高效液相色谱法进行检测，其色谱条件为：色谱柱：单官能团硅烷键合相硅胶填料；检测波长：
201nm
～
215nm
；流动相：体积比5％～
10
％的乙腈水溶液，等度洗脱
。2.
根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述有害残留物选自二硫苏糖醇
、
氧化型二硫苏糖醇
、
异丙基硫代半乳糖苷中的一种或一种以上的组合
。3.
根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述重组蛋白为病原微生物抗原性蛋白
。4.
根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述流动相流速为
0.1
～
1mL/min。5.
根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述色谱柱的单官能团硅烷键合相硅胶填料带有空间位阻侧链基团
。6.
根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测波长为
205nm
～
210nm。7.
一种用于重组蛋白生物制品中有害残留物的定量检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、
分别配制不同浓度的有害残留物的标准品溶液，采用上述任一的检测方法，获得各有害残留标准品溶液中的峰面积，并与标准品溶液浓度进行曲线拟合，得到所述线性回归方程
y(x)
；
S2、
取待测重组蛋白生物制品，配液；
S3、
取
S2
所得溶液，采...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟洋，赵萍，肖婵，吴月，韩振伟，
申请(专利权)人：上海博沃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：