本发明专利技术提供了一种能有效地特异性沉默鸡马立克氏病病毒(MDV)gI和gE的siRNA序列及其载体和在MDV基因治疗和制备基因工程疫苗中的应用。本发明专利技术使用http//www.ambion.com的靶位点筛选和设计工具，通过一步法PCR扩增含有禽源U6启动子的siRNA表达盒用于快速筛选出MDV?gI和gE基因的干扰序列。根据siRNA对应的起始位点在gI和gE基因mRNA序列上的位置，分别命名为sigI735和sigE936。构建分别含有干扰序列的siRNA真核表达载体，提取纯化的质粒转染CEF细胞，可有效抑制MDV?gI和gE基因的表达，并利用DF1、Vero、MDCK稳定细胞系进一步检测干扰序列抑制MDV?gI和gE基因表达的效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术，涉及分子生物学和基因工程
，具体涉及针对鸡马立克氏病病毒US7 (gl)和US8 (gE)基因的SiRNA序列设计、筛选及其在体外抑制MDV gl和gE的应用。具体地，本专利技术涉及序列为SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3和SEQID NO 4的siRNA序列，其可以特异性干扰鸡马立克氏病病毒gl基因。
技术介绍
I. MDV的研究现状鸡马立克氏病(MD)是鸡的一种淋巴增生性病，在养殖业受到广泛关注。如果缺乏控制手段，MD将产生巨大的损失。MD在1907年被发现，1968年首次分离到鸡马立克氏病病毒(MDV)。MDV属疱疹病毒科双链DNA病毒，基因组接近180kb，MDV具有Y -疱疹病毒的生物学特性，但是根据其基因组结构被归类为a-疱疹病毒。其基因组庞大，由长独特区(UL)及其两侧的反向长重复序列(TRL和IRL)、短独特区(US)及其两侧的反向短重复序列(TRS和IRS)组成。MDV包括三种血清型，凡能引起肿瘤的MDV均属于血清I型(MDV-I)，而天然不致瘤的MDV和火鸡疱疹病毒(HVT)分别属于血清2型和血清3型。相比其他a -疱疹病毒，MDV具有如下特点严格的细胞结合特性，在淋巴细胞中建立潜伏感染，基因组中包含的致癌基因能够产生淋巴瘤。从1969年开始，MD就通过疫苗免疫得到了很好的控制。然而，伴随着MDV毒力不断增强，疫苗的免疫效果逐步降低，病毒不断演化迫使我们必须加快MD新疫苗的研发进度以应对毒力不断增强所带来的疾病控制压力。然而，新疫苗研发速度还远跟不上病毒进化速度，这对家禽业无疑一个潜在的最大威胁。另外，，强化商品鸡的生产管理、使鸡早期接触病毒或接种低剂量病毒也是控制该病的一个好方法。现有的结果证明，MD疫苗能有效地控制该病，但是并不能阻止病毒的进化。CVI988病毒株仍然是当前控制MD的最好的疫苗，应对(或者适应)将来不断进化的MDV毒力增强的趋势，开发免疫效果更好的新型MD疫苗是控制该病的一种战略需要。在MD的控制环节上有三个关键控制点，即呼吸道、细胞间播散、病毒门户(羽毛毛囊上皮细胞)，这三个环节任何一点的突破都会对MD的控制产生跨越性的影响。_4] 2. MDVrI和gE基因及其表达蛋白的研究现状。gl和gE是MDV基因编码很重要的病毒糖蛋白，位于MDV的基因组的US区，在所有的a -疱疹病毒中均存在编码gE的同源基因，gE中都具有2个保守的半胱氨酸簇，并且gE蛋白C端的半胱氨酸簇在所有的a -疱疹病毒中都有5个半胱氨酸残基，说明疱疹病毒属各成员的gE具有相似的功能很保守。与I型单纯疱疹病毒(HSV_1、VZV、PRV等)有很高的同源性，影响体外病毒的生长。gE是一个重要的毒力基因，gl也与毒力有关，且对诱导完全保护是必须的。gE和gl基因是以非共价键形式结合成复合体gl/gE，它们与MDV在淋巴组中的侵袭和扩散作用密切相关，是影响病毒生长的功能成分。有文献报道gl/gE是病毒复制、增殖必需基因，gE是gG Fe受体，利用细胞的衔接机制来帮助病毒在细胞间扩散。且gl-gE复合物有助于介导病毒侵入细胞，在细胞间传播起到重要的作用(Schumacher et al. , 2001 ；shamblin et al. , 2004 ；Tischer et al.,2002)。Knapp等的研究证明，缺失gl/gE的PrV对大鼠的毒力大幅度降低，但将BHV-I的gl/gE克隆到该PrV突变株后，重组病毒又恢复了对大鼠的毒力。BHV-I的同源区段能够弥补PrV gE和gl缺失株对小鼠的毒力缺损，这也进一步证明疱疹病毒同源gE蛋白具有相互互补的功能。通过对BHV-IgE缺失突变病毒体外表现型的分析揭示，gE对病毒分泌和蚀斑的缩小都有利。3. RNA干扰的研究现状RNA干扰(RNA interference,RNAi)是序列特异的双链RNA(dsRNA)使细胞内同源mRNA降解，从而产生特异性基因表达沉默的过程。它是机体的一种小分子RNA介导的序列特异性免疫保护机制，可以对抗侵入性遗传因子的作用。自1998年首次被报道以来，RNAi技术以其特有的优越性而被迅速应用于抗病毒及其相关方面的研究中，目前已在HBV、HCV、流感病毒等的抗病毒研究中取得重要进展。已有成功的可抗丙型肝炎表达小干扰RNA的转基因鼠。MicroRNAs (miRNAs)是众多生物体内的主要基因表达调节因子，包括病毒。当前，已报道MDV基因组的MEQ和LAT区域编码6个miRNAs。另外，识别了 17个新的血清特性型HiiRNAs0这些miRNAs在致病过程和疫苗免疫应答中的作用功能分析工作正在开展。RNAi的作用主要由长约19_21nt的dsRNA介导,其中一类称为小干扰RNA(smallinterfering RNA, siRNA),它和目的mRNA序列具有严格的配对，能引起相应mRNA降解。由于RNAi是SiRNA靶向作用mRNA引起的特异性降解，因此要产生有效RNAi的关键是选择合适的SiRNA作用靶点。目前RNAi靶点的选择原则可以概括为以下几点①选择GC含量在50%左右的mRNA区域；②避免选择启动子起始部位下游50_100nt以内或终止子上游50-100nt内的区域避免超过三个G或三个C的重叠，因为多聚G或多聚C能形成类聚物而干扰RNAi的沉默机制；④选择以两个AA开始的序列，这将使合成siRNA更加容易； 保证靶序列与其他基因没有同源性。目前，制备siRNA的方法主要包括化学合成法、体外转录法、长片段dsRNA经RNaseIII降解法、siRNA表达载体转录法及PCR制备的siRNA表达框法等5种。
技术实现思路
本专利技术根据SiRNA设计原则，选择的siRNA其序列的GC含量分别为47. 5 %和52%，对应的起始位点在gl和gE基因mRNA序列上的位置，分别命名为sigI735和sigE936。构建针对MDV gl和gE基因的siRNA真核表达载体，提取纯化质粒后，转染CEF细胞可有效地抑制MDV gl和gE基因的表达，再通过DFl、Vero、MDCK稳定细胞系进一步检测干扰序列抑制MDV gl和gE基因的表达效果。在一个方面中，本专利技术提供一种针对MDV gl和gE基因的siRNA序列，其核苷酸序列是sigI735 正义链 5 ' CAATTCCCATGTCGATGCA 3 ' (SEQ ID NO :I)，反义链5' TGCATCGACATGGGAATTG 3' (SEQ ID NO :3) ;sigE936 正义链 5' AGATGTCCAGGTAGACGAT3' (SEQ ID NO : 2);反义链 5' ATCGTCTACCTGGACATCT 3' (SEQ ID NO :4)。在第二个方面中，本专利技术提供包含上述第一个方面所述的siRNA序列的载体。在一个实施方案中，所述载体为pGEM-T Easy载体。在一个实施方案中，所述载体特征在于按下述方法构建而成一步法PCR扩增含有禽源U6启动子的特异性干扰gl和gE基因的cU6-3-siRNA的表达盒，将其定向克隆到pGEM_T Easy载体，构建得到pGEM-T-cU6-3-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种特异性干扰鸡马立克氏病病毒gE基因的siRNA序列，其特征在于所述siRNA序列为：sigE936：正义链5′AGATGTCCAGGTAGACGAT？3′；(SEQ？ID？NO：2)？？？？？？？？？反义链5′ATCGTCTACCTGGACATCT？3′。(SEQ？ID？NO：4)
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王云峰，赵妍，石星明，崔红玉，刘长军，王玫，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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