一种乌鸡低聚肽的制备及其活性肽段的分离、鉴定方法，属于生物医药技术领域。具体步骤为：将白条乌鸡绞碎、加水、加热、去脂等前处理，然后加入Protamex酶解，再经过离心、超滤、浓缩和喷雾干燥等工序，制得乌鸡低聚肽。经检测，乌鸡低聚肽的分子量小于1000Da的组分占85％以上。乌鸡低聚肽具有较高的DPPH自由基清除活性，其IC50值为4.52mg/mL。而且乌鸡低聚肽具有较强的ACE抑制活性，其IC50值为2.86mg/mL。采用RP-HPLC法和Q-TOF2法分离鉴定出部分活性肽段，其中2个抗氧化活性肽段，即LWR和NM；5个降血压活性肽段，即LER、GAGP、KPGV、LH和NM。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属生物医药
技术介绍
乌鸡是我国家禽品种中的珍禽，具有特殊的营养滋补与药用价值。乌鸡营养价值丰富，主要化学成分为蛋白质、脂肪、钙、磷、铁、镁、维生素BI、B2等，含有组成人体蛋白质所需要的20多种氨基酸，对人体有特殊的滋补作用。《本草纲目》中记载，乌鸡有补虚劳羸弱、治消渴、益产妇、治妇人崩中带下及一些虚损诸病的功用。传统乌鸡制品在提高生理机能、延缓衰老、强筋健骨以及对防治骨质疏松、佝偻病、妇女缺铁性贫血症等方面的功效更 是得到了现代科学研究的普遍证实。研究表明，乌鸡所含20种氨基酸中，必需氨基酸齐全，其含量均高于其他鸡种，如谷氨酸含量达14. 75%、天门冬氨酸8. 97%、赖氨酸8. 08%、亮氨酸7. 61 %、丙氨酸5. 37%、酪氨酸5. 37%、精氨酸5. 25%等。此外，乌鸡含胆固醇较低，是老年人和心脑血管疾病患者最理想的滋补保健食品之一。乌鸡在我国广泛养殖，我国目前乌鸡存栏数已超过5000万只。然而，乌鸡制品的生产仍多以初加工为主，缺乏深度加工和利用。市场上的乌鸡制品，如乌鸡精、乌鸡口服液、虫草乌鸡王等，其生产工艺大多是通过水煮(如公开号CN101133859A ；CN1682977A)或加酸水解的方法对乌鸡肌肉组织进行消解，使蛋白质溶出，再经过浓缩、过滤、中药配伍等步骤，制成口服液、膏状制剂等不同剂型的产品。乌鸡制品的传统生产工艺多有不足之处，影响产品的品质和功效。水煮法只能破坏肌肉组织，使蛋白质溶出，蛋白质分解程度小，不能使活性肽段充分释放出来，制得的乌鸡肉汁杂质多，外观混浊。酸水解法采用高浓度的盐酸对乌鸡蛋白长时间的加压水解，虽然能使蛋白质水解成易吸收的氨基酸，但很少生产活性肽段，而且在高酸性条件下，氨基酸的结构极易被破环，使其丧失营养价值。另外，蛋白质的酸水解过程中，极易产生一种叫做氯丙醇的致癌物。针对传统工艺的不足，后来的研究者采用酶解法开发乌鸡新产品，如公开号为1093912A的专利技术专利提供了一种乌鸡口服液的制备方法，将乌鸡肉绞碎，加水搅拌，在一定温度和PH条件下，用1398蛋白酶水解，水解液精制后，与枸杞提取液和蜂蜜混配乌鸡口服液。另一项专利技术专利CN1404764A公开了一种乌鸡营养成分的提取新工艺，将乌鸡肉加热煮烂，降温，加入木瓜蛋白酶水解，制成乌鸡营养液。以上这些研究专利技术，虽对乌鸡传统工艺有所改进，但对乌鸡低聚肽及其营养保健功能缺乏深度了解和开发。现代营养学研究证实，食源性低聚肽(相对分子质量小于IOOODa)与原蛋白质和相同比例的混合氨基酸相比具有更多优点，低聚肽在肠道中的吸收率最好，吸收速度最快。一些小肽如二肽、三肽的吸收速度比同一组成的氨基酸快，不受消化功能障碍影响，在临床营养上有极其重要的意义。食源性肽类，尤其是低聚肽还具有低抗原、促进脂质代谢、降低胆固醇、促进矿物质吸收、降血压、抗氧化等生理功能，一些食源性低聚肽具有强化机体免疫、促进人体新陈代谢的作用。乌鸡肉蛋白氨基酸组成全面，含有丰富的活性肽段。谢明勇等采用液质(HPLC-MS)联用技术证明了乌鸡肌肉中存在较高含量的肌肽，研究推测乌鸡富含肌肽可能是乌鸡鸡种决定的，并认为乌鸡富含肌肽可能是乌鸡“滋阴清热”、“治消渴”等药用和补益作用的重要物质基础之一。林霖等对乌鸡活性肽进行了研究，发现其具有较强的体外清除羟自由基、超氧自由基的活性，随着浓度的增加，清除率逐渐增高，呈剂量关系。吴光杰等的研究表明乌鸡活性肽对体外非酶糖基化反应及其终产物的生成均有较强的抑制作用，在同等浓度条件下，乌鸡活性肽对非酶糖基化反应终产物生成抑制的效能要强于肌肽。该结果可初步认为，传统中医药认为乌鸡在治疗糖尿病(消渴)中发挥的作用可能与其所含的活性肽具有抗非酶糖基化能力有关。目前所报道的乌鸡研究中，仅对乌鸡活性肽进行了初步的探索，分子量均较大，大多集中在2000 5000Da，未见对其中的特效活性肽段进行系统研究和开发。研究表明，肽的生物活性与分子量大小有关，能在体内起活性作用的肽大多是IOOODa以下的低聚肽。因此，制备小分子量的乌鸡低聚肽，对乌鸡的精深加工和传统乌鸡制品工艺改进有着重要的意义。 为了弥补传统乌鸡制品生产工艺及乌鸡深度利用方面的不足，本专利技术采用复合酶解技术，有控制地对乌鸡蛋白进行定向水解，达到适当的水解度，最大程度地获得低聚肽，减少游离氨基酸的生成；采用微滤和超滤相结合进行分离纯化，最终精制成高纯度的乌鸡低聚肽，可作为一种高营养、多活性的功能配料。本专利技术对所制得的乌鸡低聚肽进行了特效活性肽段分离、鉴定，发现数种抗氧化和降血压的活性肽段，并采用体外功能评价方法证实了这些肽段的生理活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有抗氧化和降血压的乌鸡低聚肽；本专利技术的另一个目的在于提供一种利用酶解法制备高纯度的乌鸡低聚肽的方法；本专利技术的目的还在于提供一种从乌鸡低聚肽中分离、鉴定特效活性肽段的方法。本专利技术所述的乌鸡低聚肽其粗蛋白质含量87. 30%，脂肪为O. 34%，灰分为3.21 %,水分为5. 98%,分子量分布见表I :表I.乌鸡低聚肽的相对分子质量分布■ 分子量范围峰面积百分比(％，220nm) 10000-3000 0053000-1000 3.931000-576 11.52576-132 80.69_<132_3/71_本专利技术所述的乌鸡低聚肽的DPPH(1，1-二苯基-2-苦基肼)自由基清除活性，即IC50 值为 4. 52mg/mL。样品的DPPH自由基清除活性，即IC5tl值的定义为在一定条件下DPPH自由基清除率为50%时所需要的样品浓度。本专利技术所述的乌鸡低聚肽的降血压活性，即ACE (Angiotensin-convertingEnzyme,血管紧张素转化酶)抑制活性，IC50值为2. 86mg/mL。样品(抑制剂)的降血压活性，即IC5tl的定义为在一定的条件下ACE抑制率为50 %时所需要的样品浓度。从乌鸡低聚肽中分离鉴定出2个DPPH自由基清除活性较强的肽段，其一级结构(氨基酸序列)和IC5tl值分别是LffR Leu-Trp-Arg, IC50 值2. 80mg/mL ；NM :Asn_Met, IC50 值6. 01mg/mL。从乌鸡低聚肽中分离鉴定出2个ACE抑制活性较 强的肽段，其一级结构和IC5tl值分别是LER Leu-Glu-Arg, IC50 值0. 19mg/mL,GAGP Gly-Ala-Gly-Pro, IC50 值0. 76mg/mL。本专利技术的目的的实现方式为，一种乌鸡低聚肽的制备及其活性肽段的分离、鉴定方法，其具体步骤为I.乌鸡低聚肽的制备为了改变传统乌鸡制品生产工艺与产品品质方面的缺陷，用现代酶解技术改进传统工艺，提升乌鸡制品的营养及保健功能。本专利技术对乌鸡进行斩切、蒸煮、细化、除脂等，然后加入复合蛋白酶进行酶解、精制纯化、浓缩干燥，最终制成粗蛋白含量在85%以上，分子量在IOOODa以下的乌鸡低聚肽。蛋白质水解度的测定取二份IOmL酶解前的蛋白液样品，即样品S。、S1，另取一份IOmL酶解后的蛋白酶解液样品S2。按照GB5009. 5 “食品中蛋白质的测定”中规定的方法测定Stl的总氮Ntl ;在样品S1和S2分别中加入10mL1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种乌鸡低聚肽的制备及其活性肽段的分离、鉴定方法，其特征在于：用斩切机和绞肉机将白条乌鸡连骨带肉斩切为肉泥，加4～5倍的水，煮沸0.5h，冷却至室温。将料液用胶体磨进行细化处理后，加热至80℃，降至室温，离心去掉油脂，保留下层液料。然后将液料加温至50～60℃，调pH至6～9，加入液料固含量3～5％的Protamex酶，酶解至水解度达到70％左右，灭酶，将液料冷却到室温。用孔径50～100μm的微滤装置过滤，保留滤液。将滤液再用截留分子量为1000～3000Da的超滤装置过滤，保留滤液。在滤液中加入其固含量4～8％的活性碳，加热至80℃，搅拌1h，过滤除去活性碳。将液料真空减压浓缩至液料固含量为35％左右，将浓缩液料喷雾干燥，制得乌鸡低聚肽粉。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡木易，谷瑞增，易维学，马勇，董哲，潘兴昌，林峰，马永庆，徐亚光，鲁军，金振涛，陈亮，刘文颖，
申请(专利权)人：中国食品发酵工业研究院，
类型：发明
国别省市：
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