本发明专利技术为一种鸭黄病毒及以该毒株制备油乳灭活疫苗的制备方法，属于兽医传染病领域。所述鸭黄病毒为鸭黄病毒AH-F10株，保藏编号为：CCTCC?V201213。本发明专利技术通过临床分离纯化病毒，将纯化后的病毒液经过甲醛灭活，与油乳佐剂乳化后制成鸭黄病毒灭活油乳剂疫苗。本发明专利技术所制备的鸭黄病毒灭活疫苗具有较好的免疫效果，对动物的不良反应较小，在暂无商品疫苗的情况下，适合小规模的养殖单位对鸭群免疫及科研实验使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗鸭黄病毒灭活油乳疫苗的制备方法。
技术介绍
自2010年以来，在华东地区首次发生鸭黄病毒感染蛋鸭引发的鸭产蛋下降-死亡综合症的流行，并迅速传播到浙江、安徽、福建、江苏等省份的主要养殖场，之后传播到广东、山东、河南、河北等省市，到目前为止全国大部分主要水禽养殖地区均已受到该病的威胁。鸭子感染该病毒后，主要的临床表现为病鸭出现高热、沉郁、厌食等；蛋鸭出现产蛋量急剧下降甚至停产；肉鸭出现生长迟缓。该病的发病率高达100%，死亡率在5% 10%之间。该病毒属于黄病毒科、黄病毒属的坦布苏病毒。该病在我国属于首次报道，其病原的生物学特性，分子流行病学和分子致病机理 等方面的研究均刚刚起步，而该病近年来在我国水禽养殖区域的广泛流行以及其造成的巨大经济损失，更应加快研究鸭黄病毒病的疫苗的研究。本专利技术制备的鸭黄病毒疫苗免疫效果较好，能够较好的预防鸭黄病毒病。
技术实现思路
本专利技术的目的是制备一种鸭黄病毒灭活疫苗，以预防鸭黄病毒病的流行。本专利技术的目的之一是提供一种鸭黄病毒，该病毒株保藏在中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏名称为鸭黄病毒AH-FlO株，保藏日期2012年4月18日，保藏编号为CCTCC N0:V201213o本专利技术的另一目的是对所专利技术的鸭黄病毒疫苗进行免疫效果的评价。本专利技术鸭黄病毒灭活疫苗的制备方法，其制备步骤如下将病毒第5代鸡胚尿囊液(即上述所收获的病毒尿囊液)中按体积比加入3%。甲醛于37°C摇床灭活36小时，灭活完成后，按体积比灭活病毒液96份，吐温-80 4份摇匀，即得制苗用抗原，由它做为下步乳化的水相；白油佐剂做为下步乳化油相；按体积比油相3份、水相I份的比例取油相、水相搅拌乳化，制备成鸭黄病毒灭活油乳剂疫苗，并加入体积浓度1%硫柳汞溶液使之中终浓度为万分之一，摇匀备用。本专利技术鸭黄病毒的分离方法，其步骤如下从感染鸭黄病毒的病鸭中无菌采集其卵巢病变组织，将其研磨匀浆后反复冻融三次，12000r/min离心lOmin。;无菌条件下取其上清液，将上清液经O. 22um微孔滤膜过滤除菌后接种10日龄SPF (即无特定病原体)鸡胚，O. 2mL/枚，于38°C孵化箱孵育，弃去24小时内接种死亡的鸡胚，收获48小时至120小时内死亡鸡胚尿囊液，连续传至5代，收获病毒尿囊液备用。与已有技术相比，本专利技术有益效果体现在本专利技术制备鸭黄病毒灭活疫苗的毒株分离自安徽地区，病毒能够在鸡胚中稳定的传代，针对地方流行的鸭黄病毒病具有更好的保护性。本专利技术所制备的鸭黄病毒灭活疫苗采用成熟稳定的制作方法，具有较好的免疫效果，对动物的不良反应较小，在当下暂无商品疫苗的情况下，适合小规模的养殖单位对鸭群免疫及科研实验使用。本专利技术建立了琼扩方法检验抗体的效价，检验结果重复性好，快速准确。附图说明图I是抗原与周围六孔的琼扩抗体之间出现清晰的六条相连的沉淀线图2是抗原与2°抗血清，2—1抗血清中间出现清晰的沉淀线具体实施例方式以下通过具体实施例对本专利技术技术方案做进一步解释说明。实施例I 从安徽区域感染鸭黄病毒的病鸭中无菌条件下采集其卵巢等病变组织，将其研磨勻衆后反复冻融三次，12000r/min离心lOmin。无菌条件下取其上清液,将上清液经O. 22um微孔滤膜过滤除菌后接种10日龄SPF (即无特定病原体)鸡胚，O. 2mL/枚，于38°C孵化箱孵育,弃去24小时内接种死亡的鸡胚，收获48小时至120小时内死亡鸡胚的尿囊液，将收获的一代病毒尿囊液接种10日龄SPF鸡胚，O. 2mL/枚，于38°C孵化箱孵育。收获48小时至120小时内死亡鸡胚的尿囊液，获取第二代病毒尿囊液，如此连续传至5代，收获尿囊液备用。在收获的第5代病毒尿囊液中按体积比加入3%。甲醛于37°C摇床灭活36小时，灭活完成后，按灭活病毒液96份，吐温-80 (即聚山梨酯-80)4份摇匀，即为制苗用抗原做为下步乳化的水相；白油佐剂做为下步乳化油相。按体积比油相3份、水相I份的比例取油相、水相搅拌乳化，制备成鸭黄病毒灭活油乳剂疫苗，并加入1%硫柳汞溶液使之终浓度为万分之一，摇勻备用。AH-FlO株稳定性试验将PCR检测为阳性的鸭黄病毒病料研磨处理后接种10日龄SPF鸡胚，每枚O. 2mL。接种后置于38°C孵化箱，连续观察7天。将24小时至120小时内死亡鸡胚收取尿囊液，连续传至5代，病毒液仍可至鸡胚100%死亡，获得稳定的鸭黄病毒AH-FlO株。疫苗评价试验从非黄病毒病疫区购买50只30周龄健康产蛋麻鸭(产蛋率为86. 7%)，随机分为A, B, C，D四组，A，B两组个15只，C，D两组各10只。各组之间隔离饲养。A，B两组实验鸭分别经颈部皮下注射黄病毒灭活疫苗2mL/只，C，D两组实验鸭经颈部皮下注射灭菌后的生理盐水2mL/只，连续观察10天，期间各组实验鸭无不良反应，无发病及死亡现象。实验鸭会对注射产生应激反应，各组实验鸭注射疫苗或生理盐水后3天内，产蛋量有所下降，各组下降率分别为13. 3%，13. 3%，10%, 10%，第4天后渐渐回升，直至一周后恢复到注射前水平。注射疫苗后连续观察2周，期间各组实验鸭无发病，产蛋率无异常。注射疫苗后第15天，对A，B, C三组各实验鸭腿部肌肉注射黄病毒五代病毒尿囊液，每只lmL，D组实验鸭腿部肌肉注射生理盐水ImL.连续观察两周。结果为免疫后攻毒的A，B组与注射生理盐水的对照组D组各实验鸭均无不良反应，产蛋率下降分别为13. 3%, 13. 3%, 10%ο攻毒组C组，攻毒后产蛋量持续快速下降，直至一周后停产。两周的观察期满后，将各组实验鸭捕杀剖检发现A，B，D三组各实验鸭无明显病变，D组各实验鸭均出现卵泡萎缩，有散在出血点，肠道、泄殖腔弥漫性出血等病变。由此可见本专利技术黄病毒灭活疫苗具有良好的安全性，较好的免疫保护性。实施例2以制备的鸭黄病毒灭活油乳剂抗原免疫体型健壮，体重约为2Kg新西兰大白兔，操作如下于新西兰大白兔颈部皮下注射油乳剂疫苗O. 5mL/只；两周后颈部皮下注射油乳剂疫苗ImL/只，进行强化免疫；间隔两周后用灭活油乳剂疫苗再次强化免疫一次，颈部皮下注射2mL/只，此后每四周加强免疫一次，每次颈部皮下注射油乳剂疫苗2mL/只，第三次免疫的一周后心脏采血，制备抗血清。抗鸭黄病毒多克隆抗体反应性检测。将收获的第5代病毒尿囊液中按比例加入3%。甲醛于37°C摇床灭活36小时，制备成琼扩抗原。在1%的琼脂糖凝胶平板上用七孔梅花打孔器打孔，中间孔加入琼扩抗原，周围六孔加入等量抗鸭黄病毒多克隆兔抗血清，于37°C 湿盒中反应15小时后琼扩反应出现，中间孔与周围六孔之间出现清晰的六条相连的沉淀线如图I所示。抗鸭黄病毒多克隆抗体效价的测定。在1%的琼脂糖凝胶平板上用七孔梅花打孔器打孔，将兔抗血清用PBS稀释为2—1，2_2，2_3，2_4，2_5中间孔加入琼扩抗原，周围六孔依次加入等量原浓度抗血清，2-1抗血清，T2抗血清，2-3抗血清，抗血清，2-5抗血清，于37°C湿盒中反应20小时后观察看出，2°抗血清，抗血清，与中间孔之间有沉淀线产生，即抗体效价为1:2，如图2所示；说明该黄病毒灭活疫苗具有良好的免疫性。权利要求1.一种鸭黄病毒，其特征在于，该病毒株保藏在中国典型培养物保藏中心，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸭黄病毒，其特征在于，该病毒株保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏名称为鸭黄病毒AH？F10株，保藏编号为：CCTCC？NO:V201213。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王桂军，占松鹤，耿照玉，张建军，王汉清，王晓旭，吴启有，孙裴，徐前明，朱良强，潘鑫，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：
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