人可溶性MICA蛋白酶联免疫吸附测定试剂盒制造技术

一种人可溶性MICA蛋白酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体（1）和包被层（3），固相载体（1）上设置有多个微孔（2），包被层3附着在固相载体（1）的微孔（2）表面，包被层（3）是小鼠抗人可溶性MICA蛋白单克隆抗体和牛血清蛋白依次涂布在微孔（2）上形成的复合层。本实用新型专利技术采用ELISA方法的试剂盒可以定量检测血液或其它来源生物液体中可溶性MICA蛋白含量，显著提高了可溶性MICA蛋白检测结果的准确度；并且灵敏度高，特异性强，几乎不受液体中其它物质，如酶抑制剂、激活剂等的影响，不受药物的干扰，且操作简单，省时省力，特别适用于可溶性MICA蛋白的检测。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及生物
，尤其涉及一种用于检测可溶性MICA (sMICA)分子的试剂盒。
技术介绍
酶联免疫吸附测定法(enzymelinked immunosorbent assay, ELISA)是将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机的结合起来的一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法，可敏感的检测体液中的微量的特异性蛋白。MICA (MHC class I related chain A)基因，是人类主要组织兼容复合体I类(MHC I)相关的基因之一。MICA分子是表达在细胞膜表面的糖蛋白。与MHC-I类分子不 同，MICA的表达仅局限于人体纤维细胞、内皮细胞和大多数的肿瘤细胞。在应急和感染的情况下，MICA分子的表达增高。在肿瘤细胞的转移和器官移植的状况下，MICA的表达也有增高的现象。NKG2D作为重要的激活性受体，可与MICA分子结合。从而激活NK细胞和⑶8+T细胞的杀伤效果。NKG2D-MICA是机体先天免疫激活的重要活化通路。除了膜结合的MICA蛋白的分子形式外，MICA膜分子可能被酶切作用释放进入外周血循环，形成游离的可溶性MICA (Solube MICA, sMICA)分子，在肿瘤患者血液中尤为明显。近年来有研究检测血清中sMICA浓度在肝病患者明显增高，包括慢性肝病患者和肝细胞肝癌患者。而且他们还发现血清高浓度的sMICA能够在体外实验中下调NK细胞的NKG2D受体表达量。大量研究表明sMICA浓度的变化与许多疾病的发生发展相关，具有一定的诊断价值。
技术实现思路
本技术要解决的技术问题是提供一种检测sMICA蛋白的ELlSA试剂盒，其操作简便，成本低，稳定性好，适合于血液及其它生物液体中sMICA蛋白的检测。为了解决上述技术问题，本技术所采用的技术方案是一种人可溶性MICA蛋白酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体I和包被层3，固相载体I上设置有多个微孔2，包被层3附着在固相载体I的微孔2表面，包被层3是由抗人可溶性MICA蛋白单克隆抗体和牛血清白蛋白依次涂布在微孔2上形成的复合层。本技术采用ELlSA方法的试剂盒可以定量检测血液或其它来源生物液体中可溶性MICA蛋白含量，显著提高了可溶性MICA蛋白检测结果的准确度；并且灵敏度高，特异性强，几乎不受液体中其它物质，如酶抑制剂、激活剂等的影响，不受药物的干扰，且操作简单，省时省力，特别适用于可溶性MICA蛋白的检测。附图说明图I本实用型新一具体实施例酶标板结构示意图。图2本ELlSA试剂盒对标准sMICA*008不同稀释浓度的检测。图3正常人群血清sMICA浓度分布。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本技术作进一步说明，以使得本领域的技术人员可以更好的理解本技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本技术的限定。如图I所示，本技术试剂盒的酶标板，其包括固相载体I和包被层3，固相载体I采用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)。固相载体I上有多个微孔2，包被层3附着在固相载体I上的微孔2上。包被层3是包括小鼠抗人可溶性MICA蛋白单克隆抗体和牛血清白蛋白的复合层。该具体实施例的试剂盒制备方法是可采用96孔、48孔、60孔或12孔板。或8 12孔的联排管，例如采用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，是PS板活化。在试剂板微孔2上先包被一定浓度的捕获抗体，该捕获抗体是小鼠抗人可溶性MICA蛋白单克隆抗体，为IgGl亚型。4°C过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板，以备标本检测。 使用时将待测样本血清用含2%牛血清白蛋白的PBS缓冲液按1:3稀释加样。加样后的酶标板在37°C孵育2小时。用PBS缓冲液洗涤6次后，向每孔加入sMICA特异性的检测抗体。该检测抗体也是小鼠抗人可溶性MICA蛋白单克隆抗体，该检测抗体是IgG2 Q亚型，与捕获抗体的区别在于其结合抗原表位不同。浓度为I. 0 ug/ml，每孔加入lOOul。37°C孵育2小时。用PBS缓冲液洗涤5次后，向每孔加入标记有HRP的羊抗鼠IgG2 Q亚型的多克隆抗体。用含I %牛血清白蛋白的PBS缓冲液稀释到浓度为1:5000，每孔100ul，37°C孵育I小时，PBS缓冲液洗涤5次。加底物3，3’ -5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)作为显示底物。加硫酸中止显色反应。于酶标仪450nm的波长测定吸光度值。每一酶标板设有标准曲线样本的检测。本实施例采用的是双位点一步法，也可以采用双抗夹心法，在这种情况下采用采用生物素化的兔抗人可溶性MICA蛋白多克隆抗体，亲和素辣根过氧化物酶作为检测试剂A和B，以及3，3’ -5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)和硫酸作为底物和终止液。采用标准浓度样品以及88名正常对照者作为研究对象进一步分析。标准sMICA重组蛋白质为MICA*008型别蛋白，其仅含有细胞外MICA结构分子。从检测的标准曲线综合统计分析，如图2所示表明血清中sMICA的浓度在100-2000 pg/ml范围内与定量夹心ELlSA法检测出来的吸光度值(OD)呈现很好的直线关系(r=0. 9922)。其标准曲线以每个稀释点(pg/ml)重复三次的OD样本均值(Mean)和标准差(SD)绘制而成。我们对当地志愿献血者中随机抽取88例健康者进行血清sMICA浓度的定量测定。如图3所示健康正常人群血清中的sMICA浓度分布为近似的对数正态分布。健康人群中血液sMICA浓度的对数值频率分布(n=88，Mean=L 373，SD=O. 016)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人可溶性MICA蛋白酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体（1）和包被层（3），其特征在于：所述固相载体上设置有多个微孔（2），所述包被层附着在所述固相载体（1）的微孔（2）表面。

【技术特征摘要】
1.一种人可溶性MICA蛋白酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体(I)和包被层(3)，其特征在于所述固相载体上设置有多个微孔(2)，所述包被层附着在所述固相载体(I)的微孔(2)表面。2.如权利要求I所述的一种人可溶性MICA蛋白酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所述固相载体(I)为96孔试剂板。3.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚拯，罗奇志，余平，林琳，刘立民，
申请(专利权)人：龚拯，
类型：实用新型
国别省市：