一种植物乳杆菌肠道定殖性的定性、定量测定方法技术

本发明专利技术公开了一种植物乳杆菌肠道定殖性的定性、定量测定方法。该定性测定方法包括如下步骤：（1）将经预处理后的被测粪便样品进行总DNA提取；（2）然后进行总DNA的PCR扩增；（3）之后进行V3区PCR扩增；（4）将步骤（3）获得的V3区PCR扩增后的产物进行变性梯度凝胶电泳，以及凝胶成像图谱分析；（5）将步骤（4）得到的变性梯度凝胶的条带与空白组以及对照标记组相比对，即可。该定量测定方法包括如下步骤：分别将被测样品、植物乳杆菌系列浓度的菌粉，按前述步骤（1）~（4）操作，然后将系列浓度植物乳杆菌变性梯度凝胶上条带亮度与含量之间建立标准曲线，之后依据标准曲线计算定殖的植物乳杆菌数量。该方法快速、简便。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物研究領域，涉及ー种植物乳杆菌肠道定殖性的定性、定量測定方法。
技术介绍
植物乳杆菌是乳酸杆菌中的ー种，多数是从植物中分离得到。植物乳杆菌通过与病原菌对限制性营养素的能力竞争，来抑制病原菌的生长，调节肠道微生态的组成，形成生物学屏障。同时，通过其代谢所产生的有机酸、细菌素、过氧化氢以及双こ酰等对其他细菌的作用，可以调节肠道微生物菌群的平衡，增强机体的免疫力，降低胆固醇水平，抑制肿瘤细胞的形成等。植物乳杆菌在人体或动物中具有多种对健康的调节和促进作用，这些作用的发挥，其前提条件是其必须能粘附到黏膜的表面或者相关部位上皮细胞上，进行生长和繁殖，并与已存在或可能侵入该部位的致病菌通过竞争性排除和替代、共凝集和拮抗等作 用，使自己定殖(又称“定植”)而抑制其它微生物生长。研究植物乳杆菌在肠道定殖性，对于了解其在宿主体内定殖情况与益生菌的筛选具有非常重要的意义。研究植物乳杆菌在肠道中的定殖性，目前主要有3种方法传统上是采用选择培养计数方法，该方法操作复杂，准确度低，有很大的局限性。随着分子生物学技术的发展，尤其是细菌16SrDNA技术的发展，为植物乳杆菌的定殖性研究提供了更多方法，其中，琼脂糖凝胶电泳和实时荧光PCR图谱分析方法存在抗干扰能力差，无法在肠道菌群构成复杂的混合物中准确测定殖物乳杆菌是否存在的缺陷；而变性梯度凝胶电泳(DGGE )技术、16SrRNA与测序技术相结合的分子生物学方法则操作复杂、效率低、测试成本高、无法处理大量样品，且无法定量測定。DGGE技术是DNA指纹技术，又称为多态性分析技术的ー种，原理是在碱基序列上存在差异的不同DNA双链解链时需要不同的变性剂浓度，DNA双链一旦解链，其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降；因此，将聚合酶链式反应(PCR)扩增得到的等长的DNA片段加入到含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳，序列不同的DNA片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降，以至停留在其相应的不同变性剂梯度位置，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条帯。现有的DGGE技术一般步骤包括如下(I)细菌DNA提取，(2 ) DNA扩增,(3)凝胶电泳分离，(4 )割胶、溶胶,(5)转化，(6)克隆，(7)测序。因凝胶电泳分离结束后，每个通道上都存在很多片断，每个片断包含不定数量的DNA产物，若对凝胶图谱上所有胶带都割胶、测序，其工作量太大，费用也很高，基本是不可能的。该现状亟待解決。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服了现有的变性梯度凝胶电泳技术方法测定特定序列的DNA片段存在操作繁琐、工作量大、费用高的缺陷，而提供了可以快速、简便的植物乳杆菌定殖性的定性、定量測定方法。本专利技术提供ー种植物乳杆菌定殖性的定性測定方法包括如下步骤(I)将经预处理后的被测粪便样品进行总DNA提取；(2)然后进行总DNA的PCR扩增；使用以下引物Pl其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，P2其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，其中，所述的总DNA的PCR扩增的体系试剂含有10 X Buffer, Buffer含有500mmol. L 1 KC1> IOOmmol. L 1Tris-HCl 和 15mmol. L 1 MgCl2,0. 04mmol. L 1 dNTP (三憐酸脱氧核糖核苷酸)，O. 2mmol.じ1的引物Pl，O. 2mmol.じ1引物P2，0. 02ng/μ L步骤(I)提取得到的总DNA为模板，O. 2mmol.じ1TaqDNA聚合酶，其余为二次蒸馏无菌水；其中，所述的PCR扩增程序是①95°C预变性4min 95°C变性60S，③50°C退火60S，④72°C延伸120S;步骤② ④共25个循环，⑤72°C延伸lOmin。·(3)之后进行V3区PCR扩增；使用以下引物P3其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，P4其核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示，其中，所述的V3区PCR扩增的体系试剂含有10XBuffer，Buffer含有500mmol.L1 KC1、lOOmmol. L 1Tris-HCl 和 15mmol. L 1 MgCl2,0. 04mmol. L MNTP (三憐酸脱氧核糖核苷酸)，O. Immol.じ1引物P3，0. ImmoI.じ1的引物P4，O. Olng/μ L步骤(2)得到的总DNA的PCR扩增产物为模板，O. 15mmol.じ1TaqDNA聚合酶，其余为二次蒸馏无菌水；其中，所述的PCR扩增程序是①94°C预变性4min，②94°C变性30S，③58°C退火30S，④72°C延伸Imin ;步骤② ④共30个循环，⑤72 °C再延伸7min。(4)将步骤(3)获得的V3区PCR扩增后的产物进行变性梯度凝胶电泳，以及凝胶成像图谱分析；(5)将步骤(4)得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条带与空白组以及对照标记组的对应位置相比对，即可；其中，所述的对照标记组为植物乳杆菌(lactobacillus pIantaru)经过步骤(I) (4)得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条带；其中，此处所述的植物乳杆菌是指微生物种属水平层面上的任ー种植物乳杆菌(lactobacillus plantaru),不同植物乳杆菌菌株之间在该步骤差异较小，因而可使用同种的植物乳杆菌，更佳的为与被测粪便样品含有的植物乳杆菌在微生物种属水平层面上的同菌株的植物乳杆菌，使用的具体存在形式可为植物乳杆菌菌粉；其中，所述的空白组为被测粪便样品所属的测试对象在摄入植物乳杆菌前的粪便样品经过步骤(I) (4)处理后得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条帯。下面，进ー步对本专利技术植物乳杆菌定殖性的定性測量方法进行详细介绍本专利技术中，所述的植物乳杆菌为本领域常规所说的植物乳杆菌，较佳的为植物乳杆菌(lactobacillus plantaru) ST-III> 植物乳杆菌(lactobacillus pIantarum)LP115、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum) LP-ONLY 或植物乳杆菌(lactobacillusplantaru) 6003。此处即指本专利技术方法适用的植物乳杆菌种类。步骤(I)中，所述的被测粪便样品为本领域常规所用，一般为摄入植物乳杆菌5-10天进行预定埴后,停止摄入植物乳杆菌48h以上,无菌采新鲜粪便0. lg-0. 2g。步骤(I)中，所述的预处理为本领域常规操作，一般为液氮冻干，研磨，使用IOg无菌生理盐水溶解备用。步骤(I)中，所述的 总DNA提取为本领域常规操作，一般为包括如下步骤①将400 μ L TE缓冲液pH为8. 0，含有lOmmol.じ1 Tris-HCl和Immol.じ1 EDTA，加入装有经过预处理后的粪便样品O. Ig在I. 5mL离心管中悬浮后，置65°C水浴20-30分钟，再加入200 μ L10wt%的十二烷基硫酸钠、25 μ L 20 μ g/mL的胰RNA酶、30 μ L 500 μ g/ml的蛋白酶K溶液、以及100 μ L的25mg/mL溶菌酶均匀混合，再置65°C水浴20-30分钟，之后离心3分钟，取上清液100 μ L至离心管中；②然后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.ー种植物乳杆菌定殖性的定性測定方法，其特征在于，其包括如下步骤 (1)将经预处理后的被测粪便样品进行总DNA提取； (2)然后进行总DNA的PCR扩增；使用以下引物 Pl其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示， P2其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示， 其中，所述的总DNA的PCR扩增的体系试剂含有10XBuffer，Buffer含有500mmol.じ1KC1> IOOmmol. L 1Tris-HCl 和 15mmol. L 1 MgCl2,0. 04mmol. L 1 dNTP, O. 2mmol. L 1 的引物Pl，O.2mmol.じ1引物P2，O. 02ng/ μ L步骤(I)提取得到的总DNA为模板，O. 2mmol.じ1TaqDNA聚合酶，其余为二次蒸馏无菌水； 其中，所述的PCR扩增程序是①95°C预变性4min 95°C变性60S，③50°C退火60S，④72°C延伸120S;步骤② ④共25个循环，⑤72°C延伸IOmin; (3)之后进行V3区PCR扩增；使用以下引物 P3其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示， P4其核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示， 其中，所述的V3区PCR扩增的体系试剂含有10XBuffer, Buffer含有500mmol.T, 1KCI -1 OOmmol. I, 1Tri s~HC1 和 15mmol. L 1MgCl2,0. 04mmol. L 1ClNTP, O. lmmol. L 1 引物P3，O. ImmoI.じ1的引物P4，O. O lng/ μ L步骤(2 )得到的总DNA的PCR扩增产物为模板，O. 15mmol.じ1TaqDNA聚合酶，其余为二次蒸馏无菌水； 其中，所述的PCR扩增程序是①94°C预变性4min，②94°C变性30S，③58°C退火30S，④72°C延伸Imin ;步骤② ④共30个循环，⑤72 °C再延伸7min ； (4)将步骤(3)获得的V3区PCR扩增后的产物进行变性梯度凝胶电泳，以及凝胶成像图谱分析； (5)将步骤(4)得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条带与空白组以及对照标记组的对应位置相比对，即可； 其中，所述的对照标记组为植物乳杆菌(lactobacillus plantaru)经过步骤(I广(4)得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条带； 其中，所述的空白组为被测粪便样品所属的测试对象在摄入植物乳杆菌前的粪便样品经过步骤(I) (4)处理后得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条帯。2.如权利要求I所述的植物乳杆菌定殖性的定性測定方法，其特征在于，所述的植物乳杆菌为植物乳杆菌(lactobacillus plantaru) ST-III、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum) LP115、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum) LP-ONLY 或植物乳杆菌(lactobacillus plantaru) 6003 ;所述的对照标记组中的植物乳杆菌(lactobacillusplantaru)较佳的为与被测粪便样品含有的植物乳杆菌在微生物种属水平层面上的同菌株的植物乳杆菌。3.如权利要求I所述的植物乳杆菌定殖性的定性測定方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的被测粪便样品为摄入植物乳杆菌5-10天进行预定殖后，停止摄入植物乳杆菌48h以上，无菌采新鲜粪便0. lg-0. 2g ;所述的预处理为液氮冻干，研磨，使用IOg无菌生理盐水溶解备用。4.如权利要求I所述的植物乳杆菌定殖性的定性測定方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的总DNA提取为包括如下步骤①将400 UL TE 缓冲液pH 为 8. 0，含有 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐致远，刘振民，艾连中，于鹏，
申请(专利权)人：光明乳业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：