本发明专利技术公开了一种新的L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因，该基因具有序列1所示核苷酸序列。其在大肠杆菌表达系统进行了表达，DCIP法检测表达产物具有酶活性，且具有山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶双功能作用，可用于将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸（2-KLG），并且可与本研究中的L-山梨酮脱氢酶协同进行由L-山梨糖至2-KLG的转化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开了一种L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因，尤其是一种全新的L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因。
技术介绍
维生素C，又称抗坏血酸，作为人体必需的一种维生素和抗氧化剂，广泛应用于制药、食品、饮料、化妆品和饲料等工业中，2-KLG是合成维生素C的重要前体。最早实现维生素C工业化生产的工艺是德国Reichstein于1934年专利技术的所谓“莱氏法”，包括五步化学反应和一步生物转化将葡萄糖转化为2-KLG，再经酯化生成维生素C。但该法存在能耗高、消耗大量有机溶剂、环境污染严重等缺点，与“莱氏法”相比，尹光琳等专利技术的二步发酵法具有工艺流程简单、生产周期短、成本低廉等优点。在这一过程中，氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)转化D-山梨醇为L-山梨糖，L-山梨糖转变为2-KLG的过程是由一个混菌系统完成的，这一混菌发酵系统由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium,俗称大菌)和普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare,俗称小菌)组成,其中K. vulgare为产酸菌,单独培养时生长微弱,产酸较少；B. megaterium为伴生菌,不产酸,但促进K. vulgare生长或产酸。Ketogulonigenium sp.是Urbance等人与2001年定义的一个新属，其分类学位置为变形菌门(Proteobacteria), a -亚纲(Alpha proteobacteria),红细菌目(Rhodobacterales),红细菌科(Rhodobacteraceae)。在变形菌门中，已经有954株微生物进行了基因组序列测定。在K. vulgare所在的红细菌科中已有34株微生物进行了基因组序列测定并公布，主要包括红细菌属(8株)、Rueqeria属(8株)、玫瑰杆菌属(8株)，这些测序的结果将会在进化关系分析及代谢网络构建中发挥重要作用。
技术实现思路
本专利技术中以江苏江山制药有限公司提供的维生素C工业生产菌株K. vulgareWSH-OOl为研究对象，利用焦磷酸测序为基础的454GS FLX高通量测序法结合传统的Sanger shotgun测序技术进行序列测定，得到一种新的同时编码L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶的双功能基因，在国内外文献中未见报道，为一种新的分子。本专利技术要解决的技术问题是提供一种L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因，可以用来构建高产2-KLG的工程菌，简化维生素C的生产工艺。所述L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因，核苷酸序列如以下I)或2)所示I)其核苷酸序列为SEQ ID NO. I所示核苷酸序列；2)在I)限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因编码的蛋白质也是本专利技术要求保护的范围。 含有L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因的转基因细胞系或基因工程菌也属于本专利技术要求的保护范围。含有L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因的表达载体或克隆载体也属于本专利技术要求的保护范围。利用本发专利技术提供的基因构建基因工程菌的方法为I)根据本实验室对K. vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的sdh/sndh序列设计引物克隆sdh/sndh ；2)将sdh/sndh与pET28a(+)质粒连接得到重组表达载体；3)将得到的重组表达载体转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21后得到重组菌株。下面是本专利技术技术方案的具体描述质粒及重组菌的构建 将本实验室对K. vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的sdh/sndh序列扩增后连接到克隆载体PMD19-T vector上，将构建好的克隆载体转化E. coli JM109后对转化子进行菌落PCR(PCR引物5’ -3’ :GGAATTCCATATGATGAAACCGACTTCGCTGCTTTGGGC;CCCAAGCTTTTATTGCGGCAGGGCGAAGACGTAGA,下同)，验证阳性转化子(含有1737bp条带)，证明pMD19-T_sdh/sndh已经被转化到E. coli中，挑取阳性转化子培养并提取质粒测序，将测序正确的转化子提取质粒，经双酶切后回收sdh/sndh片段连接到质粒pET28a(+)上构建表达载体，将构建好的表达载体转化E. coliJM109进行菌落PCR验证阳性转化子(含有1737bp条带)，证明sdh/sndh基因已经连接到pET28a(+)上并被转化到E. coli中；将提取的阳性转化子质粒转化E. coli BL21 (DE3)，得到重组菌 E. coli-pET28a_sdh/sndh。重组菌E. coli-pET28a-sdh/sndh的诱导表达及酶活测定固体培养基(g/L):酵母膏5，蛋白胨10，氯化钠10 ;琼脂20，pH 7. 0，121° C灭菌15min,卡那霉素终浓度50 y g/mL。LB培养基(g/L):酵母膏5，蛋白胨10，氯化钠10 ;pH 7.0,121° C灭菌15min。TB培养基蛋白胨12，酵母提取物24，甘油4ml，磷酸二氢钾2. 31，磷酸氢二钾12. 54，pH 7. 0，121。C 灭菌 15min，卡那霉素终浓度 50 u g/mL, IPTG 终浓度 0. 5mM。培养条件从平板中接种重组菌于25mL的LB培养基中，转接TB培养基，接种量10%,装液量10%，诱导前菌体OD6tltl值为0. 6，添加IPTG至终浓度0. 5mM,于30°C、220rpm进行摇瓶培养，培养时间20h。发酵结束后取10D的菌液离心，以0. IM pH7. 0的磷酸盐缓冲液洗涤两次菌体，然后加入0. 5mL磷酸盐缓冲液超声波破壁处理，将全细胞、破壁上清及破壁沉淀进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。分析山梨糖脱氢酶活性的基本反应液由以下组成3ml 0. IM磷酸钾缓冲液(pH7. 0，含 0. 3% 的 Triton X-100)，0. 45ml 2. 5mM DCIP, 4. 95ml 的蒸馏水，在测量之前准备好。取0. ImL破壁后粗酶液加入10 y L的辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)30°C孵育lOmin。采用可控温、可实时监测吸光度的分光光度计，用光程0. 5-cm的比色皿，加入以下溶液0. 4ml基本反应液，0. Iml浓度为IM的L-山梨糖溶液，混合后30°C预热5min，加入经孵育后的酶液启动反应。一个酶活单位定义为Imin内liimol DCIP被催化还原所需的酶量。DCIP在600nm处的摩尔消光系数为I. 91 X IO4L moF10L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶Km值的测定配制不同浓度的L-山梨糖溶液，分别为0. 0625M、0. 125M、0. 25M、0. 5M、1M，按上述酶活测定的检测方法，分别求出每个山梨糖浓度下线性范围内的斜率k，按V= (kX60)/I. 91 XlO4 (单位mol L—1 mirT1)求出反应的初速度v,以初速度的倒数IVvi对L-山梨糖的浓度倒数1/[S]作图得一直线，求出 米氏常数Km值。实验证明此酶促反应光吸收-时间曲线前40s基本呈直线关系，因此试验中可以通过测定反应体系在前40s内的平均速度来代替本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种新的L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因，其特征在于其核苷酸序列如以下I)或.2)所示 .1)其核苷酸序列为SEQID NO. I所示核苷酸序列； .2)在I)限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，周景文，高丽丽，刘杰，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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