本发明专利技术提供了用于通过核酸扩增法特异性地扩增MTHFR基因的目标区域的引物对。使用包括含有F1引物和R1引物的引物对(1)、以及含有F2引物和R2引物的引物对(2)的引物对。由此，例如能够在同一反应液中同时扩增分别含有产生MTHFR基因的两种多态性的部分的两个目标区域。(F1)碱基长为20～28碱基长，以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8715的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸，(R1)碱基长为18～26碱基长，与以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号8817的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸，(F2)碱基长为26～36碱基长，以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10590的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸，(R2)碱基长为22～34碱基长，与以序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号10695的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于扩增MTHFR基因的引物对、含有其的MTHFR基因扩增用试剂及其用途。
技术介绍
同型半胱氨酸是蛋氨酸的代谢途径中的中间产物，一部分代谢成半胱氨酸，一部分再次代谢成蛋氨酸。报告了同型半胱氨酸在生物体内増加，则导致动脉硬化、冠状动脉疾病、心脏疾病等心血管疾病、高同型半胱氨酸血症。同型半胱氨酸的产生与亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolic reductase, MTHFR)有关，也报告了 MTHFR 基因中的多态性与前述疾病的关联性(例如参见非专利文献I)。具体而言，认为起因于MTHFR基因的多态性的MTHFR活性降低使得血中同型半胱氨酸增加，引起前述疾病的发病。MTHFR基因的多态性已知例如MTHFR*677、MTHFR*1298等。前者MTHFR*677是MTHFR基因中的第8747位的碱基的野生型为胞嘧啶(c)，突变型为胸腺嘧啶(t)。后者MTHFR*1298是MTHFR基因中的第10649位的碱基的野生型为腺嘌呤(a)，突变型为胞嘧啶(C)。例如，报告了 MTHFR基因中产生纯合子的变异MTHFR*677(T/T)，则MTHFR活性降低，血中同型半胱氨酸量上升。另一方面，报告了虽然机理并不清楚，但是MTHFR基因中杂合子的突变MTHFR*1298(A/C)或者纯合子的突变MTHFR*1298 (C/C)产生时，MTHFR活性降低，例如，甲氨蝶呤等类风湿关节炎治疗药必要剂量减少(例如参见非专利文献2)。因此，研究MTHFR基因的多种多态性在预测血中同型半胱氨酸量的上升而引起的心血管疾病等疾病的发病、以及类风湿关节炎等的治疗药剂量方面是极其重要的。另一方面，作为在基因水平分析所有疾病的原因、个体间疾病易感性即易患疾病、个体间的药效差异等的方法，广泛进行了多态性检测。所述多态性例如有点突变、所谓单核苷酸多态性(SNP)等。多态性的一般的检测方法例如有直接测序法、RFLP(RestrictionFragment Length Polymorphism,限制性片段长度多态性)分析、ASP-PCR法等。所述直接测序法例如是针对试样的目标DNA通过PCR(Polymerase chain reaction,聚合酶链式反应)扩增相当于检测对象序列的区域，分析其全部基因序列的方法。上述RFLP法例如是，首先，利用PCR扩增试样的目标DNA的相当于检测对象序列的区域。再通过根据上述检测对象序列有无目标突变而切断作用不同的限制酶，将该扩增产物切断，进行电泳从而进行分型的方法。ASP-PCR法例如是使用目的突变位于3’末端区域的引物进行PCR，通过有无扩增判断突变的方法。但是，这些方法例如必须进行由试样提取出的DNA的精制、电泳、限制酶处理等，因此需要工夫和成本。另外，进行PCR后，有必要暂时开启反应容器。因此有上述扩增产物混入到之后的反应体系内、分析精度降低的顾虑。而且，由于自动化困难，因此无法分析大量的试样。另外，上述ASP-PCR法还存在特异性低的问题。由该问题出发，近年来作为多态性的检测方法，正在实施Tm (MeltingTemperature)分析。这种方法是分析双链核酸的熔解温度(Tm)的方法，由于通过上述双链的熔解曲线的分析来进行，因此也称作熔解曲线分析。Tm分析例如为如下的方法。首先使用与含有检测目的多态性的区域互补的探针，形成被检核酸与上述探针的杂交体(双链核酸)。接着，对得到的杂交体实施加热处理，通过吸光度等信号的变动来检测随着温度上升的上述杂交体解离(熔解)成单链核酸。根据该检测结果确定Tm值，从而判断多态性。在杂交体中两个单链核酸的互补性越高则Tm值越高，互补性越低则Tm值越低。因此，在检测对象位点的多态性为X或者Y的情况下，对于含有目的多态性(例如，Y)的核酸和与其100%互补的探针形成的杂交体，预先求得Tm值(评价基准值)。接着測定被检核酸和上述探针的Tm值(測定值)。并且，若上述测定值与所述评价基准值相同，则可以判断上述被检核酸与上述探针为完全匹配(perfect match)，即上述被检核酸的检测对象位点为目的多态性(Y)。另ー方面，若上述測定值低于上述评价基准值，则可以判断上述被检核酸与上述探针为错配，即上述被检核酸的检测对象位点为另ー种多态性(X)。根据这样的方法，例如，仅通过对添加了上述探针的PCR反应液实施温度处理，进行信号測定，即可检测多态性。因此，也可以实现检测装置的自动化。但是，对于利用此类Tm分析的检测方法而言，例如存在PCR中必须特异且高效地扩增含有检测目的多态性的区域的问题。特别是，在具有多种基因多态性的情况下，分析一·种样品即需要大量的劳动力，因此也存在分析大量的样品并不实用的问题。现有技术文献非专利文献非专利文献I :福泽等《特集高血压最新研究动向基础編》，日本临床，株式会社日本临床社，2006年7月，64卷増刊5,173 ~ 176页非专利文献2:Urano 等“ Polymorphisms in the methy lenetetrahydrof o latereductase gene were associated with both the efficacy and the toxicity ofmethotrexate used for the treatment of rheumatoid arthritis， as evidenced bysingle locus and haplotype analyses.，，，Pharmacogenetics，2002 年 4 月，12 (3)，183 190 页。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的在于提供用于通过核酸扩增法特异性地扩增MTHFR基因的目的区域的引物和引物对。为了达到上述目的，本专利技术的引物为用于扩增MTHFR基因的引物，其特征在于，是含有下述(Fl)寡核苷酸的引物、含有下述(Rl)寡核苷酸的引物、含有下述(F2)寡核苷酸的引物或者含有下述(R2)寡核苷酸的引物。(Fl):喊基长为20 28喊基长，以序列编号I所不的喊基序列中的喊基编号8715的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸(Rl):喊基长为18 26喊基长,与以序列编号I所不的喊基序列中的喊基编号8817的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸(F2):喊基长为26 36喊基长，以序列编号I所不的喊基序列中的喊基编号10590的鸟嘌呤(g)为3’末端的寡核苷酸(R2):喊基长为22 34喊基长,与以序列编号I所不的喊基序列中的喊基编号10695的胞嘧啶(c)为5’末端的寡核苷酸互补的寡核苷酸本专利技术的引物对为用于扩增MTHFR基因的引物对，其特征在于，包括引物对(I)以及引物对(2)中的至少一者，所述引物对(I)包括含有上述(Fl)寡核苷酸的引 物和含有上述(Rl)寡核苷酸的引物中的至少一者，所述引物对(2)包括含有上述(F2)寡核苷酸的引物和含有上述(R2)寡核苷酸的引物中的至少一者。本专利技术的基因扩增用试剂是MTHFR基因扩增用试剂，其特征在于，包括本专利技术的MTHFR基因扩增用引物或者引物对。本专利技术的扩增方法为MTHFR基因的扩增方法，其特征在于，包括在反应体系中，以试样中本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：平井光春，小塚昌弘，
申请(专利权)人：爱科来株式会社，
类型：发明
国别省市：
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