纯化多肽的方法技术

本发明专利技术涉及改善的通过相对于结合于离子交换基质的一种或更多杂质的量，增加结合于离子交换基质的目的多肽的量来纯化目的多肽的方法。此效应通过在通过由于相反于离子交换基质的电荷的电荷而也结合于离子交换基质的方法中添加化合物来达到，减少杂质的结合多于目的多肽的结合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及改善的通过相对于结合于离子交换基质的一种或更多杂质的量，增加结合于离子交换基质的目的多肽的量来纯化目的多肽的方法。此效应通过在方法中添加化合物来达到，其通过也结合于离子交换基质减少杂质的结合多于目的多肽的结合。
技术介绍
多肽的大规模，经济纯化是对于生物技术工业越来越重要问题。多肽通过使用加工成通过插入含有该多肽的基因的重组质粒来产生目的多肽的哺乳动物或细菌细胞系进行细胞培养来产生。由于使用的细胞系是活体，常常给它们供应含有糖，氨基酸和生长因子的复合生长培养基，在一些情况中，也供给自动物血清的制备物。自饲喂给细胞的化合物的混合物及自细胞本身的副产物分离期望的目的多肽到对于用作人治疗剂足够的纯度是棘手的挑战。重组体治疗性多肽通常在几种哺乳动物宿主细胞系(包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，幼仓鼠肾(BHK)细胞，人胚胎肾(HEK)细胞，鼠骨髓瘤NSO细胞)，酵母细胞和细菌细胞(诸如E. coli)和昆虫细胞中产生。各细胞系在由细胞产生的多肽的产率和特征上具有优势和缺点。商业产生细胞系的选择常常平衡对具有递送给定产物需要的产物质量属性的能力的高产率的需求。发酵和细胞培养技术的发展大大增加了培养液中靶多肽的浓度。此上游效率的增加导致了细胞-收获阶段下游处理的瓶颈。细胞收获，或收获的细胞培养液的澄清，是几乎全部基于生物技术的产物的下游纯化中的重要过程。一旦多肽以期望的水平表达，从宿主细胞移出多肽及收获。悬浮的粒子，诸如细胞，细胞碎片，脂质和其他不溶性物质一般通过过滤或离心自含有多肽的流体移出，产生在溶液中含有目的多肽以及其他可溶性杂质的澄清的流体。自细胞碎片起初依赖于多肽表达的位点。导致一些多肽直接从细胞分泌到周围生长培养基；其他在细胞内制造。对于后者多肽，纯化过程的第I步骤涉及细胞的裂解，其可通过各种方法，包括机械剪切力，渗透休克或酶促处理进行。该分裂将细胞的整个内容物释放为匀浆物，且此外产生由于它们的小尺寸而难以去除的亚细胞碎片。这些通常通过离心或通过过滤去除。尽管更小规模，但伴随由于多肽产生过程中细胞的天然的死亡和细胞内宿主细胞多肽的释放的直接分泌的多肽，出现相同的问题。包括宿主细胞多肽，产物变体，宿主细胞DNA，小分子，方法相关的混杂物，内毒素，朊病毒和病毒粒子的杂质必需去除。使用的纯化技术必需是可缩放，有效，成本-有效，可靠及符合最终产物的严格纯度需求。当前纯化技术一般涉及多层析分离。典型过程可包括全部或至少一些以下步骤沉淀，透析，电泳，超滤，亲和层析，阳离子交换层析，阴离子交换 层析和疏水相互作用层析。常规柱层析步骤是有效和可靠的，但通常具有低产物通量。一旦获得含有目的多肽的溶液，通常使用不同层析技术的组合尝试其从由细胞产生的其他多肽的分离。在一些情况中，从杂质分离期望的多肽，其中杂质特别粘附于柱，而目的多肽不，即，目的多肽存在于〃流通”中(”阴性-模式”层析)。层析技术开发多肽的化学和物理性质以达到高程度的纯化。这些化学和物理性质一般包括尺寸，等电点，电荷分布，疏水位点和对配体的亲和性(Janson, J. C. andL.Ryden (eds. ). (1989)Polypeptide Purification:Principles, High ResolutionMethods and Applications. VCH Publishers, Inc. , New York)。层析的各种分离模式包括离子交换，层析聚焦，凝胶过滤(大小排阻)，疏水相互作用，反相和亲和层析。离子-交换层析(IEX)，包括阴离子-交换层析(AEX)和阳离子-交换层析(CEX)，通过它们的净表面电荷的差异的分离分析物(例如多肽)。IEX是从细胞碎片和其他杂质分离表达的多肽的主要工具。今天，IEX是纯化多肽，肽，核酸和其他带电的生物分子最常使用的技术之一，提供高分辨率和具有高装载容量的组分离。技术能分离它们的电性具有仅少数差异的分子物质，例如一个带电的氨基酸不同的2种多肽。这些特征使得IEX良好适合于自微量纯化和分析使用纯化流程和技术中的捕获，中间纯化或抛光步骤，至几kg产物的纯化。IEX，根据可交换的对离子命名，是可应用于可离子化的分子的纯化的过程。离子化的分子基于它们的带电基团与附接于固相支持基质的带反电荷的分子的非特异性静电 相互作用来分离，由此延缓与固相更强烈相互作用的那些离子化的分子。各类型的离子化的分子的净电荷，及其对基质的亲和性，根据带电基团数，各基团的电荷，及与带电的固相基质相互作用的分子竞争的性质而改变。这些差异导致通过IEX的各种分子类型的分辨率。在使用IEX的典型多肽纯化中，将源于宿主细胞的许多多肽的混合物，诸如在哺乳动物细胞培养中，应用于离子交换柱。在洗涤出非-结合分子之后，诸如通过以逐步或梯度-模式改变PH，对离子浓度等来调整条件，以从固相释放非-特别保留的或延缓的离子化的目的多肽及从具有不同电荷特征的多肽将其分离。AEX涉及在特定分离过程的pH及条件下阴离子目的分子与用于与附接于固相基质的带正电的分子相互作用的阴离子的竞争。相反，CEX涉及在特定分离过程的pH及条件下，阳离子目的分子与用于附接于固相基质的带负电的分子的阳离子的竞争。混合的模式离子交换层析涉及在相同的步骤中离子交换层析和疏水相互作用层析介质的组合的使用。尤其是，〃混合的-模式〃指称共价附接有疏水相互作用的混合物及阳离子交换或阴离子交换部分的固相支持基质。维生素K-依赖性多肽通过共享分子的氨基末端部分的共同结构特征区别于其他多肽。这些多肽的N-端部分，也称之为Gla-结构域，富含罕见的氨基酸，Y -羧基谷氨酸，其在由酶Y-谷氨酰羧基化酶催化的维生素K-依赖性反应中由谷氨酸合成。因为存在约2 12个Gla残基，Gla-结构域特征在于能结合二价阳离子诸如Ca2+。结合金属离子之后，这些多肽经历通过几种技术诸如圆二色性和荧光发射可测量的构象变化。在1980年代，使用含有Gla的多肽的独特性质经历金属诱导的构象变化，开发了构象特定假亲和性层析。假亲和性层析不同于常规亲和层析在于，无固定的亲和性配体涉及，且其在常规层析基质上进行(Yan S. B.，J. Mol. Recog. 1996; 9, 211-218)。Gla多肽可通过消除二价金属离子吸附于阴离子交换物质。随后，通过添加Ca2+到洗脱缓冲剂来进行洗脱。在1986年，Bjoern和Thim报道了在利用因子VII的Gla-结构域的Ca2+-结合性质的阴离子交换材料上的重组因子VII的纯化(Bjoern S.及Thim L.，ResearchDislosure, 1986, 26960-26962.)。吸附在无Ca2+的缓冲剂中实现，及因子VII的洗脱在使用具有低离子强度的含有Ca2+的缓冲剂及在弱条件下是可能的。Yan等人使用了纯化重组人多妝 C 的相同的原理(Yan S. B.等人，Bio/technology. 1990;8，655-661 )。有GLA-结构域的多肽包括，但不限于，以下多肽GAS-6，多肽S，因子II (凝血酶原)，凝血酶，因子X/Xa，因子IX/IXa，多肽C，因子VII/VIIa，多肽Z，跨膜、-羧基谷氨酸多肽1，跨膜Y-羧基谷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·查尔顿，M·纳波利，P·斯姆尔戴尔吉，A·斯托尔斯，V·皮尔扎斯，M·施罗德，
申请(专利权)人：CSL有限公司，
类型：发明
国别省市：