本发明专利技术制备了拉曼染料修饰的磷脂双层膜包裹的金纳米颗粒探针，激活的PLA2水解甘油磷脂sn-2位的脂酰键，使磷脂双层膜结构的稳定性受到破坏，导致纳米颗粒团聚，导致纳米颗粒团聚，表面等离子体发生耦合作用，在颗粒之间产生了巨大的电磁场，显著增强了颗粒表面吸附分子的拉曼信号，实现了高灵敏度的SERS检测。同时，该方法会产生光吸收性质的变化，也可以通过比色法进行检测。该方法不需要对酶底物进行标记，操作步骤简单、快速，成本低，灵敏度高，特异性强，重现性好。有望成为一种有用的PLA2定量分析方法，对于研究抗菌、抗炎症以及细胞毒性、药理毒理作用、代谢稳定性及其机制具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于ー种定量分析磷脂酶A2的生物传感方法，具体是指磷脂双层膜具有的独特的结构和性质，纳米颗粒的表面等离子体共振现象，纳米颗粒团聚产生的耦合增强和光吸收性质的改变。
技术介绍
磷脂酶A2 (PLA2)是ー系列參与磷脂代谢的酶，它广泛參与人体生理性细胞内外的传递及炎症、多种炎症相关疾病等多种病理反应。PLA2能水解甘油磷脂sn-2位的脂酰键，释放两种代谢物，即自由脂肪和溶血磷脂。目前对于PLA2的检测技术有荧光法、比色法，该方法需要合成类似磷脂成分的纳米颗粒，水解后产生荧光和顔色的变化，但是人工合成的底物不能等同于天然存在的磷脂，并且需要进行标记；还有脂质体包埋染料法，染料自身有背景，且不适合血液分析，血液成分对观察造成干扰，另外，这些方法都存在操作步骤繁琐，耗时长，灵敏度不高的缺点。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的不足，提出一种基于磷脂修饰的纳米颗粒团聚的PLA2的生物传感方法。操作简便、快速，成本低，灵敏度高，特异性好。金属纳米颗粒存在表面等离子体共振现象，当表面等离子体受到激发，在颗粒表面产生电磁场，显著增强了表面吸附分子的拉曼信号，而当纳米颗粒出现团聚时，表面等离子体发生耦合作用，在颗粒之间产生了更强的电磁场，对表面吸附分子的拉曼信号能达到IO12倍的增强作用。本专利技术的技术方案是，制备了拉曼染料修饰的磷脂双层膜包裹的金纳米颗粒探针，激活的PLA2水解甘油磷脂sn-2位的脂酰键，使磷脂双层膜结构的稳定性受到破坏，导致纳米颗粒团聚，产生耦合增強，实现SERS检测。同吋，该方法会产生光吸收性质的变化，也可以通过比色法进行检測。所述基于磷脂修饰的纳米颗粒团聚的PLA2的定量分析可以通过两种技术手段来实现本专利技术的一种技术方案中，基于磷脂修饰的纳米颗粒团聚的磷脂酶A2的生物传感方法，包括如下步骤(I)制备磷脂双层膜包裹的修饰有拉曼染料的纳米颗粒探针；⑵PLA2水解反应，PLA2水解甘油磷脂sn_2位的脂酰键，磷脂双层膜结构的稳定性受到破坏，导致纳米颗粒团聚，产生耦合增強，实现SERS检测；(3)利用SERS分析技术对产物溶液进行检测。本专利技术的另ー种技术方案中，基于磷脂修饰的纳米颗粒团聚的磷脂酶A2的生物传感方法，包括如下步骤(I)制备磷脂双层膜包裹的纳米颗粒探针；、⑵PLA2水解反应，PLA2水解甘油磷脂sn_2位的脂酰键，磷脂双层膜结构的稳定性受到破坏，导致纳米颗粒团聚，产生光吸收的变化；(3)利用紫外可见光吸收分析技术对产物溶液进行检測。以下对本专利技术做进ー步的说明。对于采用拉曼技术手段来实现对PLA2的定量分析，操作过程是取拉曼染料修饰的磷脂双层膜包裹的纳米颗粒探针储备液以及缓冲溶液于微量管中，加入包含有待测物的样品溶液，37°C反应30分钟后，取一定体积的样品对其进行SERS检测。本专利技术中，制备拉曼染料修饰的磷脂双层膜包裹的纳米颗粒探针通过已有的合成方法来实现。具体步骤是取O. 3nM纳米金溶液2mL, 10000r/min离心IOmin,用灭菌水定容为2mL，边搅拌边加入500 μ M DTNB (5，5 ^ - ニ硫双(2-硝基苯甲酸))300 μ L，室温放置2小时。称取 I. 628mg I, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine 和 I. 96mg l_m yristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine 于 25mL 圆底烧瓶，加入氯仿 / 甲醇(v/v 6 l)3mL,于旋转蒸发仪中进行蒸发,温度设定为45°C,蒸干后继续蒸发20min。将2. 3mL DTNB/AuNPs溶液在50°C恒温水浴中预热后，加入到圆底烧瓶中，在混匀器上振荡ー段时间，至瓶壁上的磷脂膜完全进入到溶液中，放入50°C恒温水浴中溶胀I小时，得到的产品溶液在12000r/min离心15min，用灭菌水定容为lmL，置于4°C冰箱备用。本专利技术中，所述基于拉曼染料修饰的纳米颗粒团聚产生耦合增强的PLA2的SERS检测方法，操作步骤是25μ L反应体系中，加入5μ L 5XTris缓冲溶液(50mM Tris-HCl,PH 7. 5)，I. 25 μ L IOOmM CaCl2溶液和6. 25 μ L上述合成的金纳米颗粒探针溶液于微量管中，再加入包含有待测物的样品溶液，充分混匀后，37°C恒温水浴中反应30分钟，取反应后的样品溶液10 μ L滴在硅片上，使用激光共聚焦拉曼光谱仪对样品进行扫描，得到样品的拉曼光谱数据。所述基于纳米颗粒团聚产生光吸收变化的PLA2的比色检测，操作过程中不需要对金納米颗粒进行拉曼染料标记，其它步骤完全一致，最后得到的产物溶液用灭菌水稀释至60 μ L，移入微量石英比色皿中，通过紫外可见光吸收分光光度计进行检测。注意，以上反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变最优結果。改变比例或试剂加入顺序可使信号的变化程度在1% 100%内变化。本专利技术制备了拉曼染料修饰的磷脂双层膜包裹的金纳米颗粒探针，激活的PLA2水解甘油磷脂sn-2位的脂酰键，使磷脂双层膜结构的稳定性受到破坏，导致纳米颗粒团聚，表面等离子体发生耦合作用，在颗粒之间产生了巨大的电磁场，显著增强了颗粒表面吸附分子的拉曼信号，实现了高灵敏度的SERS检测。同吋，该方法会产生光吸收性质的变化，也可以通过比色法进行检測。该方法不需要对酶底物进行标记，操作步骤简单、快速，成本低，灵敏度高，特异性强，重现性好。有望成为ー种有用的PLA2定量分析方法，对于研究抗菌、抗炎症以及细胞毒性、药理毒理作用、代谢稳定性及其机制具有重要的意义。具体实施例方式实施例I :蜂毒中提取的PLA2的含量分析(I)制备拉曼染料修饰的磷脂双层膜包裹的纳米颗粒探针称取I. 58mg 5，5' - ニ硫双(2-硝基苯甲酸)溶于4mL 50mM Na2HP04溶液，用灭菌水稀释为500 μ Μ(避光,备用)。取O. 3ηΜ纳米金溶液2mL, 10000r/min离心IOmin,用灭菌水定容为2mL，边搅拌边加入500 μ M DTNB (5，5' -ニ硫双(2-硝基苯甲酸))300 μ L，室温放置 2 小时。称取 I. 628mg I, 2-dimyristoyl-sn-glycero_3-phosphocholine 和 I. 96mgl-myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholin 于 25mL 圆底烧瓶，加入氯仿 / 甲醇(v/v 6 l)3mL,于旋转蒸发仪中进行蒸发,温度设定为45°C,蒸干后继续蒸发20min。将2. 3mL DTNB/AuNPs溶液在50°C恒温水浴中预热后，加入到圆底烧瓶中，在混匀器上振荡ー段时间，至瓶壁上的磷脂完全进入到溶液中，放入50°C恒温水浴中溶胀I小时，得到的产品溶液在12000r/min离心15min，用灭菌水定容为lmL，置于4°C冰箱备用。(2) PLA2水解甘油磷脂sn-2位的脂酰键，使磷脂双层膜结构的稳定性受到破坏，导致纳米颗粒团聚取蜂毒中提取的PLA2 (冻干粉形式)，用灭菌水溶解为2mg/ml (即138 μ Μ)，再分别稀释到 I. 38 μ Μ, 1本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王玉，蒋健晖，楚霞，唐丽娟，俞汝勤，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：
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