本发明专利技术涉及一种对bZIP类转录因子具有调控作用的基因、其克隆方法及其应用。该基因为SEQIDNO：1所示的碱基序列。该序列可以和bZIP类转录因子（如Opaque-2）发生蛋白互作，和互作转录因子（以Opaque-2为例）具有时空表达重叠性；在ZmTaxilin和互作转录因子（以Opaque-2为例）的亚细胞定位以及共定位中发现，ZmTaxilin可以明显改变互作转录因子（以Opaque－2为例）的亚细胞定位；在植物活细胞体系中进行转录激活活性检测，发现ZmTaxilin可以抑制互作转录因子（以Opaque-2为例）对靶标基因（以22kD醇溶蛋白基因为例）启动子的转录活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种对bZIP类转录因子具有调控作用的基因、其克隆方法及其应用。
技术介绍
玉米(Zea mays)是世界上种植面积最大并且产量最大的禾本科作物之一，大多用于动物饲料，食物以及エ业原料，在エ农业中均有着广泛的应用。玉米对于现代社会的发展起到了重要作用。但是，由于玉米蛋白质中必需氨基酸含量不完整，尤其是胚乳中含量最高的a醇溶蛋白(22kD醇溶蛋白和19kD醇溶蛋白)的赖氨酸和色氨酸严重缺乏，导致玉米本身的营养价值较差，长期以玉米为单ー粮食会导致严重的营养不良。为了改进玉米的蛋白质质量，人们进行了大量的科学研究。Opaque-2是ー个含有bZIP结构域的转录因子，并且在1987年被人们通过转座子标签技术克隆。突变体表现出了典型的粉质胚乳(图I)，并且在生化成分含量中，ベ 相对于野生型籽粒表现出了高含量的赖氨酸和色氨酸。因此，Opaque-2是ー个著名的籽粒高赖氨酸突变体。目前研究表明，转录因子Opaque-2在玉米胚乳中专ー的调控22kD醇溶蛋白的表达，并且部分调控19kD醇溶蛋白的表达。由于之前的研究中已经发现，Opaque-2可以和ー些非醇溶蛋白产生物理結合，因此，可以认为，Opaque-2在玉米籽粒发育过程中可能还担负着一些其他的重要使命。从Opaque-2克隆至今，人们通过ー些方法找到了ー些疑似和Opaque-2有关的基因，如PBF、OHPU GCN5，但是对于Opaque-2在玉米籽粒发育中具体的调控机制依然不为人知。鉴于Opaque-2本身转录因子的分子结构以及其调控的下游蛋白在玉米籽粒中的重要作用，人们普遍认为Opaque-2是ー个在籽粒发育中起到重要作用的转录因子。解释Opaque-2的具体功能对于人们改进玉米蛋白质品质具有极为重要的意义。根据之前研究的经验来看，通过蛋白相互作用的方法在转录后水平来寻找调控Opaque-2的蛋白不失为一个重要的手段。蛋白相互作用的方法包括酵母双杂筛库、体外的Pul 1-down、体内的免疫共沉淀(CoIP)等。酵母双杂实验是基于酵母体系在酵母体内筛选可能有互作的两个蛋白的方法。该实验可以大范围地筛选可能有直接互作的两个蛋白。但是，其背景信号较高，会有一些假阳性的情况出现。Pull-down是基于免疫沉淀和Western技术发展来的体外或者半体内来检测蛋白互作的ー门技木。该技术通过抗体的特异性吸附以及互作蛋白之间的相互物理性的结合来进行互作验证。该实验方法相对于酵母双杂可以大幅降低背景，但是还是不能完全体内地来验证蛋白互作。由Pull-down技术发展而来的免疫共沉淀技术可以在体内情况下验证蛋白互作。 该技术原理和Pull-down —致,都是利用了免疫沉淀和Western技术来检测蛋白互作。但是和Pull-down不同的是免疫共沉淀完全采取了内源的组织细胞表达的蛋白。因此，免疫共沉淀的难度更大对抗体的要求更高，但是结果更可靠。此外，一些其他的实验方法也可以用来进行蛋白互作之后的功能分析。包括亚细胞定位以及蛋白在植物细胞瞬时表达的酶活測定等。亚细胞定位主要是基于以荧光蛋白为标签的瞬时转化技木。可以通过基因枪对洋葱表皮细胞瞬时转化以及农杆菌侵染烟草表皮细胞或者原生质体等方法来实现对蛋白的亚细胞定位。在对互作蛋白的功能分析中，采取以⑶S为报道基因，荧光素酶为内參通过酶标仪来测定酶活的方法来对互作蛋白的功能分析进行定量检测。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于通过酵母双杂技术筛选出了ー个对bZIP类转录因子具有调控作用的基因，称为ZmTaxilin。该基因在酵母中和Opaque-2有相互作用。 本专利技术的目的之ニ在于提供该基因的克隆方法。本专利技术的目的之三在于提供其应用价值。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案为 ー种对bZIP类转录因子具有调控作用的基因，其特征在于该基因为SEQ ID N0:1所示的碱基序列。一种克隆上述的对bZIP类转录因子具有调控作用的基因，其特征在于该方法的具体步骤为 a.将均一化的玉米籽粒cDNA片段与单杂载体pGADI7-Rec连接转化,构建馆质粒,选取其中包含bZIP结构域以及核定位信号又屏蔽了其转录激活结构域02-2片段，将其连入PGBKT7载体中，构建库质粒； b.将步骤a所得的库质粒以及饵质粒转入酵母AH109中，得到酵母转化子，通过DDO与QDO的筛选，共获得了疑似阳性克隆，对该克隆质粒抽提、测序分析以及回转酵母，筛选出一个与Taxilin同源的基因，即得到对bZIP类转录因子具有调控作用的基因。上述的对bZIP类转录因子具有调控作用的基因在对转录因子下游靶标基因的转录中的调控作用。上述的对bZIP类转录因子具有调控作用的基因在和bZIP类转录因子发生相互结合并且改变转录因子在细胞内分布中的应用。上述的对bZIP类转录因子在调控bZIP类转录因子转录激活能力中作用。上述的对bZIP类转录因子具有调控作用的基因在抑制被调控转录因子对下游靶标基因的基因表达中的应用。通过RT-PCR与Real-time PCR的方法证明了本专利技术的基因ZmTaxilin与Opaque-2的表达具有时空重叠性。通过瞬时转化洋葱表皮细胞发现ZmTaxilin与Opaque-2具有一致的共定位。ZmTaxilin在洋葱表皮细胞中通过改变Opaque-2的亚细胞定位抑制了Opaque-2的功能。由于Opaque-2是ー个能够调控22kD醇溶蛋白启动子表达的转录因子。因此，将22kD醇溶蛋白启动子，Opaque-2, ZmTaxilin以及荧光素酶一同转入洋葱表皮细胞中，通过酶标仪分别检测GUS与荧光素酶的酶活。通过研究和bZIP类转录因子有互作的蛋白为线索，利用酵母双杂的方法，以Opaque-2为馆质粒,筛选出了一个含有Taxilin结构域的蛋白。通过NCBI预测，该蛋白是一个疑似的细胞骨架蛋白。通过酵母回转验证以及半体内的GST Pull-down实验,证明了和Opaque-2的互作。此外,通过对ZmTaxilin的时空表达分析发现，该蛋白和Opaque-2具有时空重叠性。在对ZmTaxilin调控Opaque-2的亚细胞定位以及功能分析中发现，ZmTaxilin在洋葱表皮细胞中可以改变Opaque-2的亚细胞定位,从而降低Opaque-2对22kD醇溶蛋白启动子的转录调控。本专利技术首次发现细胞骨架蛋白能够和bZIP类的转录因子Opaque-2发生互作，从而改变了 Opaque-2的亚细胞定位,并且抑制Opaque-2的转录调控能力。对于解释Opaque-2的具体转录后调控机制具有极为重要的意义，为高品质玉米的大规模生产奠定理论基础。本专利适用于一般玉米常规品种，具体以W22自交系为例说明。附图说明 图I是野生型与Opaque-2突变体杂交的F2代籽粒。黑色箭头分别指出了由于Opaque-2突变而导致的不透明的Opaque表型籽粒以及野生型的透明的籽粒； 图2是酵母双杂筛库中馆质粒构建的示意图。由于Opaque-2本身就是一个转录因子，具有较强的转录激活能力，所以利用Opaque-2全长基因筛库会有很高的自激活背景。因此，根据Opaque-2的序列特性，将Opaque-2全长分为三段，选择第二段02_2(即包括了 bZIP结构域本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种对bZIP类转录因子具有调控作用的基因，其特征在于该基因为SEQ ID N0:1所不的喊基序列。2.一种克隆根据权利要求I所述的对bZIP类转录因子具有调控作用的基因，其特征在于该方法的具体步骤为 将均一化的玉米籽粒cDNA片段与单杂载体pGADH-Rec连接转化，构建饵质粒，选取其中包含bZIP结构域以及核定位信号又屏蔽了其转录激活结构域02-2片段，将其连入PGBKT7载体中，构建库质粒； b.将步骤a所得的库质粒以及饵质粒转入酵母AH109中，得到酵母转化子，通过DDO与QDO的筛选，共获得了疑似阳性克隆，对该克隆 质粒抽提、测序分析...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋任涛，张男，乔祯逸，梁铮，许政暟，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：
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