本发明专利技术涉及一种测定细胞色素P450代谢活性的探针药物组合物的制备、检测方法及其应用；组合物含有CYP450的主要亚型CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的特异性探针为活性成分制备而成的制剂。配制成“cocktail”探针药液，将该探针药物组合物给予动物或者与肝微粒体体外共孵育，通过测定各探针药物的浓度而评价CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的代谢活性；在新药研发初期，高通量筛选药物对于细胞色素P450各亚型活性的影响，从而预测药物相互作用。在临床研究阶段，可以应用该探针药物组合物进行体内探针法试验，考察药物对人肝CYP450不同亚型体内代谢活性的影响。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药领域，更具体的是涉及一种新的测定细胞色素P450代谢活性的“cocktail”探针药物组合物，通过其药代动力学参数的变化来评价药物对大鼠CYP450亚型 CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 和 CYP3A4 体内、体外代谢活性的影响。
技术介绍
细胞色素P450氧化酶(cytochrome P450，CYP450)是药物在人体内氧化代谢最主要的酶，其中CYP1A2，CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1和CYP3A4是最主要的亚型，含量约占肝内CYP450总量的80%以上，且经肝脏代谢的药物中90%以上是由这6种亚型代谢的。许多因素如遗传因素、年龄、性别、疾病和环境等都可以影响CYP450的活性，CYP450的活性可影响药物的代谢过程，从而影响药物的疗效；而且药物对CYP450可以产生诱导或者抑制作用，从而影响其他经此酶代谢的药物而发生药物相互作用和不良反应。目前临床上绝大多数患者都在多药并用，尤其是老年人，每天同时服用4 5种药物的情况极为普遍，随之而来的药物相互作用所致的不良反应也日趋严重，这已成为处方医师和患者必须认真考虑的一个重要而又现实的问题。药物相互作用一般分为药动学相互作用和药效学相互作用两大类。药动学相互作用可发生在吸收、分布、代谢、排泄4个阶段，其中代谢性相互作用发生率最高，约占药动学相互作用的40%，临床意义也最为重要，而代谢性相互作用的96%是由CYP450酶系介导的。目前欧美各国已经把对CYP450的活性测定用于新药筛选及代谢研究，并把它列为新药申报必须进行的一项实验。我国颁布的《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》中也已积极倡导对CYP450的活性进行研究。在新药筛选和发现阶段,对新化学实体(new chemical entities, NCE)进行药代动力学的综合评价，预测和完善化合物的最佳结构，已经成为新药研究中的一个非常重要的内容。良好的药动学参数和代谢特征是具有发展前景的先导化合物所必备的。因此，在新药研发过程中常通过评估NCE对CYP450特异性探针底物在体外代谢体系中代谢的影响程度，判断NCE对CYP450的抑制作用，从而预测它在体内可能引起的药物相互作用，为进一步的药物临床试验提供有价值的信息。但是体外与体内真实的生理环境有很大不同，可能造成药物代谢的差异。因此预测药物相互作用应该体内、体外研究相结合。面对大量组合化学技术产生的大量化合物和传统制备分离技术得到的天然产物中的成分，需要采用快速、简便并且结果可靠的体内外实验方法和技术进行筛选以供进一步的结构优化。目前，用于研究CYP450活性的方法主要分为体内和体外研究两大类。体外研究常用的方法有肝微粒体孵化、基因重组P450酶系、肝细胞培养和肝脏组织切片法。研究报道，使用特异性底物与肝微粒体共同孵化的方法测定的结果与临床表现具有较好的一致性，故体外研究方法中肝微粒体孵化法更加可靠。体外研究简单快速，适合高通量筛选。还可以作为确定体内试验研究方向的预试验而应用。但是体外与体内真实的生理环境有很大不同，使药物代谢可能会有所差异，因此需要进一步进行体内研究。体内研究方法主要有基因分型法和探针药物法。基因分型法是直接测定特定的DNA的变异来评价药物代谢酶的活性。但是个体代谢酶基因变异发生频率较低，有很多还未被认定而且是非特征性，再加上基因型检测费用高，并不是所有的基因型变异都导致表现型改变等都限制了该方法的实际应用。最常使用的是直接测定体内酶的活性(表现型)的方法即探针药物法，探针药物法目前主要分为两种。一种是单独使用一种探针药物，即选用只被一种特定的酶亚型催化或者即使被几种亚型催化但已确知其代谢途径及其产物的物质，通过测定其体内的代谢速率，来评价该酶的活性的指标。然而外源物质的代谢往往需要多种酶共同参与，而且酶多具有底物特异性，单一的探针药物只能反映一个或部分CYP450亚型的活性，没有一种药物可以同时评价几种亚型的活性。实践中又常需要了解多个CYP450亚型的活性，于是发展出了同时给予多个探针药物的方法，即“cocktail”探针药物法。该方法可以明显减少分析周期，提高分析效率，更重要的是这种方法可以减少个体内的差异对实验结果的影响。近年来这 种方法得到了广泛的研究，然而对其在药物开发过程中的适应性还存在一定的质疑，其中主要关注于各探针药物之间的代谢性相互作用以及探针药物的药效学作用。同时cocktail探针药物法对分析方法的敏感性和特异性要求较高，这样就会提高分析成本。但有研究指出在满足分析方法的各种要求前提下，潜在的相互作用可以通过控制药物的剂量来降低，而且随着现在许多高特异性和高灵敏度方法的使用，目前检测检测大多数药物血浆浓度的常用方法有气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)和色谱-质谱联用法(LC-MS、LC-MS/MS、GC-MS, GC-MS/MS)等，但这些精密仪器仍然受到试验室现有条件及方法应用的普及性的限制。Cocktail探针药物法是由Breimer和Schellens等人在80年代末提出来的,研究最多的是用3 5种探针药物组成的cocktail溶液，使用LC/MS/MS的方法同时测定药物对3 5种主要CYP450亚型活性的影响，所用的特异性探针药物各不相同。最近，FDA、EUFEPS和美国内外科医师协会认为在体内药物代谢/相互作用的研究中，CYP450各亚型相对应的理想探针药物分别为CYP1A2为胆茶碱、咖啡因；CYP2C9为华法林和甲苯磺丁脲；CYP2D6为地昔帕明和美托洛尔；CYP3A4为咪达唑仑和司伐他汀；CYP2C19为奥美拉唑；CYP2E1为氯唑沙宗。CYP1A2，CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 和 CYP3A4 是 CYP450 最主要的六种亚型，含量约占肝内CYP450总量的80%以上，且90%以上的上市药物是由这6种亚型代谢的。因此对于药物的评价应该涵盖这六种主要的CYP450亚型。本课题组在前期工作中曾制备了包含咖啡因、甲苯磺丁脲、美托洛尔、氯唑沙宗和咪达唑仑的5种探针药物的cocktail溶液，并用其评价了肝缺血再灌与缺血预适应对大鼠CYP450五种亚型CYP1A2，CYP2C9，CYP2D6, CYP2E1和CYP3A4活性的影响(专利申请号:200810110435. 6)。该方法中缺少了CYP2C19这一重要的CYP450亚型，而且检测方法采用了单一波长的HPLC法，其回收率较低，无法准确测定低浓度的药物。CYP2C19与CYP2C9同属CYP2C家族，是重要的CYP450酶，能催化许多临床药物，如奥美拉唑、安定、环己巴比妥、普萘洛尔等，同时具有明显的遗传多态性。本研究在前期工作的基础上，制备了一种新的细胞色素P450探针药物组合物，进一步优化探针溶液的配伍条件，增加其稳定性；使用HPLC梯度洗脱法使得各探针药物的分离度更好、提高了测定方法的准确度和精密度。为研究药物对CYP450六种主要亚型活性的影响提供了一种新的方法。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种新的测定CYP450代谢活性的探针药物组合物，研究了药物对大鼠CYP450六个主本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种测定细胞色素P450代谢活性的探针药物组合物，其特征是由含有CYP450的主要亚型CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的特异性探针为活性成分制备而成的制剂。2.如权利要求I的组合物，其特征是所述的 CYP1A2特异性探针为活性成分的是咖啡因或茶碱； CYP2C9特异性探针为活性成分的是甲苯磺丁脲或华法林； CYP2C19特异性探针为活性成分的是奥美拉唑或美芬妥因； CYP2D6特异性探针为活性成分的是美托洛尔或右美沙芬； CYP2E1特异性探针为活性成分的是氯唑沙宗或氨苯砜； CYP3A4特异性探针为活性成分的是咪达唑仑或地昔帕明。3.如权利要求2的组合物，其特征是所述的组合物的组分和质量份数如下 咖啡因3 12份， 美托洛尔18 35份， 奥美拉唑18 35份， 氯唑沙宗10 20份， 甲苯磺丁脲3 10份， 咪达唑仑10 20份。4.如权利要求I 3的任何一项权利要求所述的组合物的制备方法，其特征是步骤如下 (1)称取氯唑沙宗10 20份和甲苯磺丁脲3 10份溶于无水乙醇，备用； (2)称取探针药物咖啡因3 12份、美托洛尔18 35份、奥美拉唑18 35份溶于生理盐水,将(I)加入此溶液中； (3)再准确吸取咪达唑仑10 20份加入上述混合液，配制成“cocktail”探针药液，使各探针药物的浓度分别为咖啡因0. 3 I. 2mg/ml，美托洛尔I. 8 3. 5mg/ml，奥美拉唑I.8 3. 5mg/ml,氯唑沙宗I 2mg/ml,甲苯横丁服0. 3 lmg/ml,咪达唑仑I 2mg/ml。5.权利要求I的测定细胞色素P450代谢活性的探针药物组合物的应用，将该探针药物组合物给予动物或者与肝微粒体体外共孵育，通过测定各探针药物的浓度而评价CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的代谢...
【专利技术属性】
技术研发人员：李芹，娄建石，焦建杰，刘洁，汪云，张才丽，
申请(专利权)人：天津医科大学，
类型：发明
国别省市：
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