本发明专利技术涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种体外诱导间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的方法，技术方案：构建SRF基因的重组真核表达质粒，真核表达载体包括是pEGFP、pcDNA或pCMV；将人间充质干细胞首先预诱导为nestin+细胞，进一步诱导为胰腺始祖细胞，然后将含有SRF基因的真核表达载体转染到上述细胞中，最后诱导为胰岛素分泌细胞。本发明专利技术可为糖尿病的细胞治疗提供新的种子细胞来源，为间充质干细胞的定向诱导分化为胰岛素分泌细胞和其临床应用提供新的理论和实验依据，并为与之相关的药物开发和筛选提供了新的模型。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于干细胞诱导分化研究领域，涉及一种诱导干细胞分化的方法，尤其是。
技术介绍
糖尿病是一组以血葡萄糖水平增高为特征的代谢性疾病，主要是由于胰岛素分泌相对或绝对不足或胰岛素受体作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱性疾病。糖尿病死亡率仅次于心脑血管和肿瘤，严重威胁人类生命和健康。随着其发病率的逐年上升，糖尿病对人类健康的危害还将进一步加重。世界卫生组织估计，全世界有I. 8亿人患有糖尿病，这一数字很可能到2030年将翻番一倍以上。在糖尿病治疗方面，传统的治疗无外乎促进β细胞胰岛素的分泌、增加外周组织对胰岛素的敏感性及使用外源胰岛素几个方面，然而这些治疗策略显然未能使糖尿病患者得到根治；胰腺移植和胰岛移植又难以克服供体不足和免疫排斥这两大问题，使其临床应用和效果也受到极大影响。因此迫切需求治愈糖尿病的新方法。干细胞以其极强自我更新和多向分化潜能，已成为人们寻找替代患者自身免疫系统破坏的胰岛细胞的最佳种子细胞来源，以干细胞移植为主的再生治疗为糖尿病的根治带来了新的希望。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs),是目前最有应用优势的种子细胞。间充质干细胞具有非常强的自我增殖能力和分化的多潜能性，国内外的研究表明能根据特定的环境分化为胰岛素分泌细胞，并且间充质干细胞具有其它干细胞所不可比拟的优点，如取材方便、增殖和分化能力强、移植无免疫原性，同时也避免了胚胎干细胞移植所面临的伦理问题。目前对于间充质干细胞向胰岛细胞分化的诱导方案可以归为以下两类多数为集中神经生长因子及活化素的联合应用，如bFGF、EGF等；另一种方法是转染胰岛细胞发育、胰岛素分泌过程中的关键基因，如roX-l、Ngn3等转录因子。但是现有研究诱导分化方案有很大局限性，分化效率不高，应用时效果不理想。血清反应因子(SRF)是一种高度保守且广泛存在于多种生物体内的转录调控因子，它可以与多个基因启动子上CArG box位点特异性结合，进而特异性上调靶基因的转录表达水平。目前发现其主要功能是参与调节细胞内骨架肌动蛋白和其他一些支架蛋白的基因转录过程，进而参与多种哺乳动物生理过程，例如肌原纤维发育及其分化为骨骼肌、平滑肌等过程。最新的研究发现胰岛素基因启动子上含有SRF的结合位点CArG box,并且SRF和PDX-I可以协同促进胰岛素基因的转录，但是利用SRF与生长因子组合共同诱导间充质干细胞向平滑肌细胞分化尚未见报道
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，本方法利用SRF基因修饰与多种生长因子协同诱导间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是，包括以下步骤 (I)构建含有SRF基因的重组真核表达质粒；(2)诱导人间充质干细胞向Nestin+细胞分化当步骤(I)中细胞至70_80%融合时，去除原有培养基，加入诱导培养基I培养5 6小时；所述步骤⑵中所述诱导培养基I为含有5mmol/L β -巯基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖；(3)诱导Nestin+细胞向胰腺始祖细胞分化在步骤(2)获得细胞中，去除步骤(2)中诱导培养基I，加入诱导培养基II培养7 8天；步骤(3)中所述的诱导培养基II为含有5 20nmol/L bFGF、5 20nmol/L EGF,2% B27、0. 1% β -巯基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖；(4)诱导胰腺始祖细胞向胰岛素分泌细胞分化在步骤(3)获得细胞中，去除步骤(2)中诱导培养基II，加入诱导培养基III，同时转染步骤(I)中的SRF基因的重组真核表达质粒，培养7 8天；步骤⑷中所述的诱导培养基III为含有5 20nmol/L Exendin_4、5 20mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖。而且，步骤(I)中构建含有SRF基因的重组真核表达质粒，真核表达载体为pEGFP、pcDNA3. I 或 pCMV。而且，步骤(2)中所述的人间充质干细胞包括羊水、骨髓、胎盘、脐带血或脂肪组织来源的间充质干细胞。而且，步骤(4)中所述的SRF真核表达质粒为去内毒素的质粒，质粒超螺旋带型清晰，A260/A280 = I. 8 2. O。而且，所述步骤(3)中所述的诱导培养基II为含有10nmol/L bFGFUOnmoI/L EGF、2% B27.0. 1% β-巯基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖。而且，所述步骤(4)中所述的诱导液培养基III为含有10nmol/L Exendin-4、10mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖。本专利技术的优点和积极效果如下I、本专利技术首次将SRF用作诱导间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化过程中的修饰基因，并首次将转染SRF和多种生长因子组合共同诱导间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化。2、本专利技术利用生长因子组合诱导间充质干细胞分化为胰腺始祖细胞(此时细胞高表达rox-i)，同时对细胞进行基因修饰，上调细胞中的SRF表达，并辅以生长因子和活性物质将可能获得分泌胰岛素的细胞，此方法的建立对于研发基于干细胞移植治疗为主的“再生医学”具有重要意义和实用价值。3、本专利技术所述的Effectene Transfection Reagent转染系统转染效率高，并且安全性好。4、本专利技术可为间充质干细胞的向胰岛素分泌细胞定向诱导分化和其临床应用提供新的理论和实验依据，并为与之相关的药物开发和筛选提供了新的模型。附图说明图I为本专利技术利用SRF的上、下游引物对SRF基因进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，M为分子量marker，I代表扩增PCR产物片段；图2为本专利技术所构建的SRF质粒进行双酶切验证，M为分子量marker，I为所构建质粒进行双酶切后的电泳图。图3为本专利技术利用诱导培养基组合三步诱导法诱导人间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的细胞形态图，其中，图3-1代表未诱导组的间充质干细胞的形态；图3-2代表利用诱导培养基I诱导间充质干细胞分化为nestin+细胞的形态变化情况；图3_3代表利用诱导培养基II诱导nestin+细胞分化为胰腺始祖细胞的形态变化情况；图3_4代表利用诱导培养基III诱导胰腺始祖细胞分化为胰岛素分泌细胞的形态变化情况。图4为本专利技术利用诱导培养基组合三步诱导法诱导人间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化后，利用双硫腙染色检测胰岛素分泌细胞团，其中，图4-1代表未诱导组的间充质干细胞进行双硫腙染色；图4-2代表利用生长因子诱导后双硫腙染色，说明利用诱导培养基组合诱导后出现表达胰岛素的细胞团。图5为本专利技术利用诱导培养基组合三步诱导法与转录因子SRF共同诱导人间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化后，利用RT-PCR检测分化后细胞表达胰岛素基因mRNA水平，其中A代表诱导培养基组合三步诱导法诱导间充质干细胞分化后，胰岛素基因mRNA水平；B代表诱导培养基组合三步诱导法与转录因子SRF共同诱导人间充质干细胞分化后，胰岛素基因mRNA水平。说明在诱导培养基组合与转录因子SRF共诱导之后胰岛素的mRNA水平较闻。图6为本专利技术利用诱导培养基组合三本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王楠，张同存，俞如发，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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