本发明专利技术公开了一种适应无血清培养的HEK293细胞系及其应用。本发明专利技术采用培养液渐进替换的方法获得了一株适应无血清培养的HEK293细胞(293SF)，其菌种保藏编号为：CGMCC?No.5824。经检测293SF细胞具有稳定的腺病毒增殖能力与外源蛋白表达能力；平均病变时间为97小时，比HEK293细胞缩短12.9％；毒价达到107.48TCID50/mL，比HEK293细胞提高43.3％；并且随着代数的提高稳定性良好，连续传16次后293SF细胞状态与易感性没有发生变化。此细胞系可用于腺病毒载体疫苗的无血清生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种细胞系及其应用，特别涉及一种适应无血清培养的HEK293细胞系及其应用。属于生物
技术介绍
血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种复杂混合物，其组成成份包括碳水化合物、血浆蛋白、多肽、脂肪、生长因子、激素、无机物等，这些物质是通过促进细胞生长或抑制细胞生长活性从而达到生理平衡的。除此之外，血清还提供除营养物质外的激素、生长因子，转运大分子的结合蛋白以及能够促使细胞贴壁并免受机械损伤的促接触和伸展因子。在常规细胞培养中，血清是一个不可或缺的成分，但仍存在一些问题。比如成份复杂，不同批次之间差异明显；而且对于大多数细胞，血清不是它们在体内的常规内环境， 只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能会改变某种细胞在体内的正常状态。无血清培养作为一种新兴的细胞大规模培养方案，在避免了上述采用有血清培养基培养的缺点的同时，并有一些新的特性，例如培养液成分明确，不同批次之间各成分含量没有差异等，这些特性提高了培养基的稳定性和实验数据的一致性，并简化了纯化和下游加工的过程；另外，无血清培养基不含动物源性大分子蛋白，避免了细胞水平和机体水平不必要的副作用(如疫苗过敏反应)。重组腺病毒载体作为一种基因转移载体系统，具有安全、病毒增殖滴度高、基因转移效率高、宿主谱广等优点，在疫苗开发、基因治疗等方面得到广泛应用。但现行的腺病毒生产工艺存在产量低、纯化困难、依赖血清培养等缺点。
技术实现思路
为了解决以上问题，本专利技术专利技术人驯化了一株能高效包装腺病毒的无血清细胞系。本专利技术以HEK293细胞为原始材料，筛选了一株适应无血清培养的细胞系，并研究了其产毒性能和稳定性。本专利技术的一株适应无血清培养的HEK293细胞系，其特征在于所述HEK293细胞系命名为293SF，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCCNo. 5824，保藏日期为 2012年2月29日。本专利技术还提供了一种建立以上所述的HEK293细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)HEK293细胞进行适应培养前，采用10% FBS DMEM对其进行培养，细胞铺满培养瓶底面时用含O. 25% EDTA的胰酶消化，1500r/min离心5min收集细胞，用适应液稀释细胞至5 X IO5个细胞/mL，进入适应阶段；(2)适应过程中采用培养液渐进替换的方法，按照以下步骤进行适应培养第I步用含有25%的无血清培养基293 SFM II和75%的含10%牛血清DMEM培养基，传代2次；第2步用含有50%的293 SFM II培养基和50%的含10%牛血清DMEM培养基， 传代2次；第3步用含有75%的293 SFM II培养基和25%的含10%牛血清DMEM培养基， 传代3次；第4步用含有87. 5%的293 SFM II培养基和12. 5%的含10%牛血清DMEM培养基，传代3次；第5步用含有95%的293 SFM II培养基和5%的含10%的牛血清DMEM培养基， 根据细胞状态，传代3 5次；第6步当第5步细胞生长快速、状态良好后，更换为100%的293 SFM II培养基传代，得到适应无血清培养的293SF细胞系。在本专利技术的方法中，其特征在于在适应过程中，当细胞密度> IX IO6个细胞/mL 时，以3X IO5 5X IO5个细胞/mL的细胞密度进行传代培养；完全更换为100%的293SFM II培养基后，当细胞密度达到I X IO6 3X IO6个细胞/mL时，以5X IO5个细胞/mL的细胞密度进行传代培养。在本专利技术的方法中，其特征在于处于适应初期的细胞传代时使用胰酶消化；当适应液中293 SFM II的比例达到95%时，停止使用胰酶，改用弯头吸管将细胞从培养瓶表面吹下。在本专利技术的方法中，其特征在于所述方法还进一步包括待细胞适应无血清培养后，采用含有400mmol/L GlutaMAX-I的293 SFM II培养液在培养条件为37°C、8% CO2的培养箱中培养。本专利技术的HEK293细胞系(命名为293SF)可用于贴壁培养或悬浮培养。为促使细胞在无血清条件下贴壁，本专利技术在培养细胞前，使用多聚赖氨酸(TOL)处理细胞培养瓶，具体操作如下用去离子水配制的PBS缓冲液稀释多聚赖氨酸至O. lmg/ml，经O. 22 μ m滤膜过滤备用；将21111多聚赖氨酸稀释液加入细胞培养瓶中，摇动培养瓶使液体铺满瓶底，放入 37°C培养箱中孵育6小时后取出；处理过的培养瓶即可用于所述的HEK293细胞系的培养；用于悬浮培养时，可直接将细胞置于未经任何处理的培养瓶中培养。进一步的，本专利技术还公开了所述的HEK293细胞系在表达外源蛋白中的应用。及所述的HEK293细胞系在培养腺病毒疫苗载体中的应用。本研究采用目前较为成熟的商品化培养基加以渐进替换法驯化HEK293细胞，最大限度地减少了培养条件对细胞的冲击，对保持细胞株活性、降低细胞株变异有重要作用。 由于无血清培养的HEK293细胞具有悬浮生长的特征，难以快速区分正常细胞与病变细胞， 因此本实验采用PDL处理过的培养瓶培养使无血清细胞贴壁，使细胞贴壁生长，以提高病毒毒价测定数据的准确性。目前市售用于无血清培养的293细胞系有多种，如GIBOC 293F、HEK-293N3S。本专利技术中驯化无血清细胞的原材料(HEK293细胞系)与以上商品化无血清细胞系相同，通过改进驯化工艺和方法获得了本细胞系，本专利技术的细胞系具有商品化细胞系的稳定性和实用性，同时也为后期实验节约了资金，降低了疫苗的生产成本。GIBOC 293F所使用的293F细胞是HEK293细胞的一个亚群，而本细胞系是采用HEK293细胞系直接驯化而来；HEK-293 N3S细胞系在国内应用较少，多采用灌流培养，而灌流培养对设备和人员要求较高，成本也较大；本研究建立的无血清HEK293细胞系能以贴壁或悬浮状态的方式生长，是目前商品化细胞系所没有达到的。贴壁生长的特性有利于提高腺病毒包装效率，悬浮生长的特性有利于腺病毒载体疫苗的大规模生产。由于无血清培养基中不含球蛋白、抗体等干扰腺病毒感染的组分，本研究方案降低了腺病毒的不必要损耗。病变时间由110小时缩短到97小时，同时产率平均提高了 43. 3%，可降低腺病毒疫苗的生产成本，同时为腺病毒疫苗生产和加工提供了便利条件。另外由于高滴度接种腺病毒会引起细胞快速裂解死亡，细胞中大部分未成熟的病毒粒子未能组装成为具有感染性的完整病毒粒子，这样可导致毒价下降，影响结果准确性； 因此本研究采用低感染复数腺病毒接种，在细胞病变初期采用IFA方法测定外源蛋白表达情况，这样既能避免腺病毒裂解作用对实验结果的影响，也能直观的对比腺病毒增殖对数期的蛋白表达情况。无血清细胞培养技术一般应用于灌注培养、生物反应器等大规模培养方案，本研究建立的无血清细胞系能够用于较大规模培养，并评价所生产的腺病毒载体疫苗。附图说明图I为完全适应无血清培养的细胞的生长状态；A 293SF 细胞；B HEK293 细胞图2为腺病毒在两种细胞中分别连续传代16次后各代的毒价测定；图3为不同细胞感染重组腺病毒后的目的蛋白表达情况。A :感染 rAd本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：仇华吉，孙元，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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