本发明专利技术涉及一种针对A型猪流感病毒NP基因的试剂盒，其组成包括：一对扩增引物、捕获探针、检测探针、NASBA扩增试剂、NASBA产物检测试剂。本发明专利技术以A型猪流感病毒NP基因作为目的基因，建立NASBA快速检测方法，用于A型猪流感病毒的诊断，提高我国猪流感诊断、疫情监测和检验检疫技术水平，保障养猪业的健康、快速发展。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物卫生检验
，涉及一种核苷酸及其应用，更具体的说是一种A型猪流感病毒NASBA-ELISA检测试剂盒。
技术介绍
猪流感(SwineInfluenza , SI)是由猪流感病毒(Swine Influenza Virus , SIV) 引起的一种急性、高度接触传染性的群发性呼吸道疾病，临床上以突发、高热、咳嗽、呼吸困难为特征。该病传播速度快，在各年龄和各品系的猪中，发病率高达100%，对于免疫系统不完善的仔猪致死率较高。此外猪流感还可引起母猪繁殖障碍、育肥猪增重减慢等，对养猪业所造成的危害和经济损失巨大。猪流感自1918年美国首次报道以来，已造成世界范围内的多次大流行，迄今已遍及欧、美、亚、非、澳洲等世界各地。猪流感病毒具有同时感染人和禽的能力，而且猪是对禽流感病毒和哺乳动物流感病毒均敏感的唯一动物，在流感病毒“禽-猪-人”的种间传播链中，充当了病毒重组及复制的“混合器”。2009年3月在墨西哥、美国等地暴发的A型流感病毒便是一种新型的变异病毒株，这种新型流感病毒包含人流感病毒、禽流感病毒和猪流感病毒的基因片段，同时拥有亚洲猪流感和非洲猪流感病毒特征。猪流感不仅给畜禽养殖造成重大经济损失，而且还对人类健康造成威胁，因此快速、敏感、准确诊断猪流感，具有重要的经济价值和公共卫生意义。核酸序列依赖性扩增(nucleicacid sequence-based amplification,NASBA)是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。NASBA的简要过程如下=(I)RNA模板链进入反应混合物后，第一个引物首先与模板链的3’端结束。 (2 )反转录酶(AMV)，合成反义的补偿的DNA链。(3 ) RNaseH,分解破坏RNA模板链。(4 )第二个引物与DNA的5’端结合。(5) T7 RNA polymerase合成RNA补偿链，并加入到步骤I 中，使反应可以循环进行。NASBA-ELISA方法是将NASBA技术和ELISA (酶联免疫吸附剂测定)方法相结合， 其原理是将地高辛标记到检测探针上，通过探针捕获探针将地高辛标记的探针和NASBA产物的复合物吸附到微量反应板上，作用于底物硝基苯基磷酸盐显色，然后通过分析吸光度来检测RNA产物。由于捕获探针和检测探针的应用，使检测结果更为特异，而酶标仪的高通量性能使一次能够检测多个样品。猪流感病毒是负链RNA病毒，病毒基因组由8个分节段的RNA组成，其中核蛋白 (NP)基因相对保守，且该基因具有种群和型的特异性，因此核蛋白经常作为流感病毒型的分类和诊断的候选基因。本专利技术以猪流感病毒NP基因作为目的基因，建立NASBA快速检测方法，用于猪流感病毒的诊断，提高我国猪流感诊断、疫情监测和检验检疫技术水平，保障养猪业的健康、快速发展。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于检测A型猪流感病毒的特异性探针。本专利技术的另一个目的是提供一种检测A型猪流感病毒NASBA-ELISA的试剂盒。 本专利技术的另一个目的是提供一种检测A型猪流感病毒NASBA-ELISA试剂盒的制备方法。 为实现上述目的，本专利技术提供如下的技术方案一对针对A型猪流感病毒NP基因的特异性捕获探针和检测探针，其特征在于，所述的捕获探针序列如SEQ NO: I所示；具有如SEQ NO: 2所示的检测探针序列。本专利技术进一步公开了针对A型猪流感病毒的NASBA-ELISA试剂盒，它是由下述成分组成I)引物和探针引物 NP-DET 2μ1 引物 ΝΡ-Τ7 2μ1 捕获探针NP-CP μ1 检测探针NP-DP μ1所述捕获探针NP-CP，具有如SEQ NO: I所示的引物序列；所述检测探针NP-DP具有如 SEQ NO:2所示的引物序列。2) NASBA 扩增试剂BA (缓冲液)40mM/L PH8. 5 Tris-HCL, 70mM /L KCl, 12mM/L MgCl2,5mM/L DTT4μ1DA 10mM/L dNTP2μ1NA 20mM/L NTP2μ1MA (酶混合液):1 2UAMV,0. 2 O. 5URNaseH, 30 50U T7 RNA 聚合酶，2 6Pllmg/m IBSA4μ1SA DMS0 μ 3) NASBA产物检测试剂 96孔酶标板链酶亲和素包被的酶标板杂交缓冲液20XSSPE ( pH7. 4),50mM/L Tris-HCl ( ρΗ8· 8)，I % BSA 43μ1 酶标抗体:碱性磷酸酶抗地高辛抗体ΙΟΟμΙ显色液3mg pNPP溶于ImLddH2O中，避光_20°C保存。ΙΟΟμΙ终止液:0. 5Μ Na2CO3 溶液。ΙΟΟμΙ洗液PBST 溶液(含 0. 05%Tween-20，ρΗ7· 2，PBS )450μ1。本专利技术进一步公开了针对猪流感病毒NASBA-ELISA检测试剂盒的使用方法，其特征是包括下述步骤1)扩增反应体系3μ1待检样品 RNA、4P1 BA、2μ1 Α、2μ1 ΝΑ、 μ1 SA、2Pl 引物 ΝΡ-Τ7、2μ1 引物 NP-DET ；2)NASBA扩增过程65°C加热5min，41°C冷却5min，迅速加入4μ1MA，41°C反应90min ； 4°C终止反应；3)NASBA产物检测过程①在酶标孔中加入杂交缓冲液43μ1、捕获探针 μ 、检测探针 μ 和NASBA产物5μ1，震荡混匀，放入41 °C温箱中反应l 2h ；②用每孔加入150μ1洗液，室温放置3 5min，弃去溶液，反复洗板3次；③每孔加入酶标抗体ΙΟΟμΙ，室温孵育30min，洗板3次；④显色每孔加入ΙΟΟμΙ显色液,室温避光显色IOmin；⑤终止反应每孔加入100终止液，在酶标议上测定405nm的OD值。本专利技术更加详细的制备方法如下I试剂组成I. I引物针对A型猪流感病毒的NP基因设计合成引物和探针，由宝生物工程(大连)有限公司合成，序列如下NP-DET :5’ -GATGCTAGGTCGCATATGAGTC-3’2μ1ΝΡ-Τ7 :5’ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCGGATGCCTTCTGTT-3’2μ1捕获探针 NP-CP:BIO- TAA GGA CCA GAA GG G μ 检测探针 NP-DP:DIG- GATGCTAGGTCGCATATGAG μ I.2 NASBA扩增试剂BA (缓冲液):40mM/L PH8. 5 Tris-HCL, 70mM /L KCl, 12mM/L MgCl2,5mM/L DTT 购自 Promega 公司4μ1DA 10mM/L dNTP，购自上海生物工程有限公司2μ1NA :20mM/L ΝΤΡ，购自上海生物工程有限公司2μ1MA (酶混 合液)1 2 U A M V , O . 2 O. 5URNaseH, 30 50U T 7 RNA 聚合 酶，2 6Pllmg/mlBSA 4μ1SA DMS0,购自天津博美科生物工程有限公司 μ 1.3 NASBA产物检测试剂96孔酶标板链酶亲和素包被的酶标板，购自上海生物工程有限公司杂交缓冲液20XSSPE ( ρΗ7· 4)，50mM Tris-HCl ( ρΗ8· 8)，I % 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：鄢明华，李秀丽，张莉，王荣升，王东，孙英峰，韩伟，张国伟，路超，张健，池晶晶，
申请(专利权)人：天津市畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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