表达多基因抗流感转基因动物的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种表达多基因抗流感转基因动物的构建方法。该方法在RNA聚合酶Ⅲ型启动子h7SK、hH1、hU6和mU6的控制下，靶向流感病毒基因构建了串联表达的shRNA表达盒，将Mx-RNAis与shRNA表达盒联合构建到表达载体并包装重组慢病毒，制备转基因动物获得表达抗流感基因的转基因动物。实验结果表明转基因动物具有显著抑制猪流感病毒复制的活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于属于生物
，具体地说，本专利技术涉及表达多基因抗流感转基因动物的构建方法。
技术介绍
猪流感是由正粘病毒科A型流感病毒属的猪流感病毒引起的猪呼吸道疾病。目前，猪流感已遍布美洲、亚洲、欧洲和非洲等地，是规模化养猪场普遍存在且难以根除的群发性疾病，给养猪业带来巨大经济损失。猪流感病毒不仅危害猪群，而且可引起禽类流感和人流感的发生。所以，研究猪流感具有重要的公共卫生意义。A型流感病毒容易发生抗原变异，且主要以两种形式出现：一种是因为病毒基因发生点突变引起的抗原漂移，另一种是由于两种不同流感病毒共同感染一个细胞而发生基因重配，产生新的病毒亚型，从而导致病毒蛋白的抗原性发生变化，后者因为病毒抗原性发生较大改变而称之为抗原转变。抗原漂移与抗原转变都会改变病毒表面蛋白抗原性，主要影响流感病毒血凝素为主，其次是神经氨酸酶(VijaykrishnaDetal.，2011)。在体内和体外的研究中，都表明猪是A型流感病毒进行基因重组的温和宿主，在其体内存在α-2，6唾液酸受体和α-2，3唾液酸受体，能够促进其他流感病毒基因进行重组而进化新病毒株。这些“新”流感毒株产生后能够感染的猪、人类和禽类(Zhangetal.，2009)。通过系统发育和流行病学分析以及分子生物学研究，都证实在猪宿主细胞内有通过不同的父母病毒基因重组而产生的新病毒存在。本领域技术人员，致力于通过找到一些具有抵抗某种病毒的基因或者蛋白，然后将其或者编码蛋白的基因作为目的基因转入动物体内，获得能够高效表达该基因的转基因动物，从而起到抵抗病毒的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种表达多基因抗流感转基因动物的构建方法及其应用。本专利技术的第一方面，提供了一种shRNA构建物，所述shRNA构建物包括第一siRNA编码序列，所述第一siRNA特异性靶向流感病毒PB1基因或其片段。在另一优选例中，所述第一siRNA的编码序列包括核苷酸序列：AAGATCTGTTCCACCATTGAA(SEQIDNO.:13)。在另一优选例中，所述第一siRNA的编码序列含有式Ia所示的结构：Seq正向a-Xa-Seq反向a式Ia式中，Seq正向a核苷酸序列如SEQIDNO.:13所示；Seq反向a为与Seq正向a基本上互补的核苷酸序列；Xa为位于Seq正向a和Seq反向a之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向a和Seq反向a不互补。在另一优选例中，所述第一siRNA的编码序列如下所示：5’-AAGATCTGTTCCACCATTGAATTCAAGACGTTCAATGGTGGAACAGATCTT-3’(SEQIDNO.:14)在另一优选例中，所述第一siRNA的编码序列还包含与式Ia序列可操作性连接的hH1启动子序列。所述hH1启动子序列启动所述式Ia序列的转录。在另一优选例中，所述hH1启动子序列如SEQIDNO.:15所示。在另一优选例中，所述shRNA构建物还包括第二siRNA编码序列，所述第二siRNA特异性靶向流感病毒PA基因或其片段。在另一优选例中，所述第二siRNA的编码序列包括核苷酸序列：AAGCAATTGAGGAGTGCCTGA(SEQIDNO.:16)。在另一优选例中，所述第二siRNA的编码序列含有式Ib所示的结构：Seq正向b-Xb-Seq反向b式Ib式中，Seq正向b核苷酸序列如SEQIDNO.:16所示；Seq反向b为与Seq正向b基本上互补的核苷酸序列；Xb为位于Seq正向b和Seq反向b之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向b和Seq反向b不互补。在另一优选例中，所述第二siRNA的编码序列如下所示：5'-AAGCAATTGAGGAGTGCCTGATTCAAGACGTCAGGCACTCCTCAATTGCTT-3'(SEQIDNO.:17)在另一优选例中，所述第二siRNA的编码序列还包含与式Ib序列可操作性连接的h7SK启动子序列。所述h7SK启动子序列启动所述式Ib序列的转录。在另一优选例中，所述h7SK启动子序列如SEQIDNO.:18所示。在另一优选例中，所述shRNA构建物还包括第三siRNA编码序列，所述第三siRNA特异性靶向流感病毒NP基因或其片段。在另一优选例中，所述第三siRNA的编码序列包括核苷酸序列：AAGGATCTTATTTCTTCGGAG(SEQIDNO.:19)。在另一优选例中，所述第三siRNA的编码序列含有式Ic所示的结构：Seq正向c-Xc-Seq反向c式Ic式中，Seq正向c核苷酸序列如SEQIDNO.:19所示；Seq反向c为与Seq正向c基本上互补的核苷酸序列；Xc为位于Seq正向c和Seq反向c之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向c和Seq反向c不互补。在另一优选例中，所述第三siRNA的编码序列如下所示：5'-AAGGATCTTATTTCTTCGGAGTTCAAGACGCTCCGAAGAAATAAGATCCTT-3'(SEQIDNO.:20)在另一优选例中，所述第三siRNA的编码序列还包含与式Ic序列可操作性连接的mU6启动子序列。所述mU6启动子序列启动所述式Ic序列的转录。在另一优选例中，所述mU6启动子序列如SEQIDNO.:21所示。在另一优选例中，所述shRNA构建物还包括第四siRNA编码序列，所述第四siRNA特异性靶向流感病毒PB2基因或其片段。在另一优选例中，所述第四siRNA的编码序列包括核苷酸序列：AAAGCAACTAGAAGGCTGATT(SEQIDNO.:22)。在另一优选例中，所述第四siRNA的编码序列含有式Id所示的结构：Seq正向d-Xd-Seq反向d式Id式中，Seq正向d核苷酸序列如SEQIDNO.:22所示；Seq反向d为与Seq正向d基本上互补的核苷酸序列；Xd为位于Seq正向d和Seq反向d之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向d和Seq反向d不互补。在另一优选例中，所述第四siRNA的编码序列如下所示：5'-AAAGCAACTAGAAGGCTGATTCTATGGACAAATCAGCCTTCTAGTTGCTTT-3'(SEQIDNO.:23)在另一优选例中，所述第四siRNA的编码序列还包含与式Id序列可操作性连接的hU6启动子序列。所述hU6启动子序列启动所述式Id序列的转录。在另一优选例中，所述hU6启动子序列如SEQIDNO.:24所示。在另一优选例中，所述所述shRNA构建物包括核苷酸序列SEQIDNO.:25。在另一优选例中，所设计的shRNA，分别在RNA聚合酶Ⅲ型启动子h7SK、hH1、hU6和mU6的控制下，以DNA序列的形式构建转录shRNA的表达盒。在本专利技术的一个优选的实施方式中，所述shRNA构建物还包括Mx-RNAis序列，优选地，将CMV启动子启动表达的Mx-RNAis基因和由四个不同启动子分别启动表达的shRNA串联，从而构建shRNA-Mx-RNAis构建物。优选地，上述shRNA-Mx-RNAis构建物的核苷酸序列如SEQIDNO.:26所示。本专利技术的第二方面，提供了一种shRNA，所述shRNA由本专利技术第一方面所述的shRNA构建物转录而来。本专利技术的第三方面，提本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种shRNA构建物，其特征在于，所述shRNA构建物包括第一siRNA编码序列，所述第一siRNA特异性靶向流感病毒PB1基因或其片段；优选地，所述第一siRNA的编码序列包括核苷酸序列SEQ ID NO.:13；更优选地，所述第一siRNA的编码序列含有式Ia所示的结构：Seq正向a‑Xa‑Seq反向a   式Ia式中，Seq正向a核苷酸序列如SEQ ID NO.:13所示；Seq反向a为与Seq正向a基本上互补的核苷酸序列；Xa为位于Seq正向a和Seq反向a之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向a和Seq反向a不互补；最优选地，所述第一siRNA的编码序列还包含与式Ia序列可操作性连接的hH1启动子序列。

【技术特征摘要】
1.一种shRNA构建物，其特征在于，所述shRNA构建物包括第一siRNA编码序列，所述第一siRNA特异性靶向流感病毒PB1基因或其片段；优选地，所述第一siRNA的编码序列包括核苷酸序列SEQIDNO.:13；更优选地，所述第一siRNA的编码序列含有式Ia所示的结构：Seq正向a-Xa-Seq反向a式Ia式中，Seq正向a核苷酸序列如SEQIDNO.:13所示；Seq反向a为与Seq正向a基本上互补的核苷酸序列；Xa为位于Seq正向a和Seq反向a之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向a和Seq反向a不互补；最优选地，所述第一siRNA的编码序列还包含与式Ia序列可操作性连接的hH1启动子序列。2.如权利要求1所述的shRNA构建物，其特征在于，所述shRNA构建物还包括第二siRNA编码序列，所述第二siRNA特异性靶向流感病毒PA基因或其片段；优选地，所述第二siRNA的编码序列包括核苷酸序列SEQIDNO.:16；更优选地，所述第二siRNA的编码序列含有式Ib所示的结构：Seq正向b-Xb-Seq反向b式Ib式中，Seq正向b核苷酸序列如SEQIDNO.:16所示；Seq反向b为与Seq正向b基本上互补的核苷酸序列；Xb为位于Seq正向b和Seq反向b之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向b和Seq反向b不互补；最优选地，所述第二siRNA的编码序列还包含与式Ib序列可操作性连接的h7SK启动子序列。3.如权利要求1所述的shRNA构建物，其特征在于，所述shRNA构建物还包括第三siRNA编码序列，所述第三siRNA特异性靶向流感病毒NP基因或其片段；优选地，所述第三siRNA的编码序列包括核苷酸序列SEQIDNO.:19；更优选地，所述第三siRNA的编码序列含有式Ic所示的结构：Seq正向c-Xc-Seq反向c式Ic式中，Seq正向c核苷酸序列如SEQIDNO.:19所示；Seq反向c为与Seq正向c基本上互补的核苷酸序列；Xc为位于Seq正向c和Seq反向c之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向c和Seq反向c不互补；最优选地，所述第三siRNA的编码序列还包含与式Ic序...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟庆文，王伟，陈洪岩，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23