本发明专利技术公开了抗猪瘟病毒感染的siRNA及其应用，属于抗猪瘟病毒siRNA的鉴定及其应用领域。本发明专利技术首先公开了分别靶向猪瘟病毒基因组Npro、P7、NS5A和NS5B基因的抗猪瘟病毒感染的siRNA，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1-12所示。本发明专利技术进一步利用构建的重组猪瘟病毒筛选出对猪瘟病毒干扰或抑制活性最强的siRNA，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.12所示。本发明专利技术还公开了含有所述抗猪瘟病毒感染的siRNA的表达载体及其应用。本发明专利技术抗猪瘟病毒感染的siRNA对猪瘟病毒抑制活性强，具有制备成预防或治疗猪瘟的药物或试剂的潜力。
【技术实现步骤摘要】
本申请是申请号为“201410252667.0”、申请日为“2014年6月9日”、专利技术名称为“抗猪瘟病毒感染的siRNA及其应用”的分案申请。
本专利技术涉及抗猪瘟病毒siRNA，尤其涉及靶向猪瘟病毒基因组的抗猪瘟病毒感染的siRNA，本专利技术进一步涉及靶向猪瘟病毒基因组的具有抗猪瘟病毒感染活性的siRNA在制备预防或治疗猪瘟的药物或试剂中的应用，属于抗猪瘟病毒siRNA的鉴定及其应用领域。
技术介绍
猪瘟(classicalswinefever，CSF)是由猪瘟病毒(classicalswinefevervirus，CSFV)引起的一种接触性、致死性传染病，以高热和出血为其典型特征，发病率和死亡率极高，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的动物疫病。猪瘟病毒(CSFV)是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员，为单股正链线性RNA分子。CSFV基因组大小为12.3kb，两端分别为5′端非翻译区(untranslatedregion，UTR)和3′端UTR，中间包含一个大的开放阅读框(Openreadingframe，ORF)，其中ORF编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白。该多聚蛋白在病毒感染的宿主细胞内，受宿主或病毒特有的蛋白酶的水解作用，可裂解为11种病毒特异性蛋白，包括4种病毒结构蛋白(C、Erns、E1和E2)和7种非结构蛋白(Npro、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)(Moennig,V.,2000.Introductiontoclassicalswinefever:virus,diseaseandcontrolpolicy.Vet.Microbiol.73,93–102.)。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是抗病毒感染最有效的方法之一。应用RNAi技术可以减少病毒RNA的数量、阻断病毒蛋白的表达以及抑制病毒的复制等，此技术已在多种疾病的基因治疗研究中，发挥出了巨大的潜力和独特的效果。现有的研究表明，靶向猪瘟病毒Npro、NS3、NS4A和NS5B基因的siRNA可以抑制CSFV的复制(Xu,X.,Guo,H.,Xiao,C.,Zha,Y.,Shi,Z.,Xia,X.,Tu,C.,2008.InvitroinhibitionofclassicalswinefevervirusreplicationbysiRNAstargetingNproandNS5Bgenes.AntiviralRes.78,188–193；Li,J.,Dai,Y.,Liu,S.,Guo,H.,Wang,T.,Ouyang,H.,Tu,C.,2011.InvitroinhibitionofCSFVreplicationbymultiplesiRNAexpression.AntiviralRes.91,209–216.)。CSFVP7为II类离子通道蛋白，在瘟病毒的生命周期中起着至关重要的作用，并与病毒的致病性有关(Gladue,D.P.,Holinka,L.G.,Largo,E.,Sainz,I.F.,Carrillo,C.,O'Donnell,V.,Baker-Branstetter,R.,Lu,Z.,Ambroggio,X.,Risatti,G.R.,Nieva,J.L.,Borca,M.V.,2012.Classicalswinefevervirusp7proteinisaviroporininvolvedinvirulenceinswine.J.Virol.86,6778–6791.)。NS5A在CSFV生命周期的确切功能知之甚少，迄今尚无靶向CSFVP7和NS5A基因的抗猪瘟病毒siRNA的报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供分别靶向猪瘟病毒基因组Npro、P7、NS5A和NS5B基因的具有抗猪瘟病毒感染活性的siRNA，这些siRNA具有应用于预防或治疗猪瘟的药物或试剂的潜力，实现对猪瘟的有效防治。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案实现的：本专利技术根据猪瘟病毒基因组Npro基因的编码序列，设计靶向猪瘟病毒基因组Npro基因的抗猪瘟病毒siRNA，其核苷酸序列为SEQIDNO.1-3所示。本专利技术根据猪瘟病毒基因组P7基因的编码序列，设计靶向猪瘟病毒基因组P7基因的抗猪瘟病毒siRNA，其核苷酸序列为SEQIDNO.4-6所示。本专利技术根据猪瘟病毒基因组NS5A基因的编码序列，设计靶向猪瘟病毒基因组NS5A基因的抗猪瘟病毒siRNA，其核苷酸序列为SEQIDNO.7-9所示。本专利技术根据猪瘟病毒基因组NS5B基因的编码序列，设计靶向猪瘟病毒基因组NS5B基因的抗猪瘟病毒siRNA，其核苷酸序列为SEQIDNO.10-12所示。本专利技术为了鉴定所设计的这些siRNA是否具有抗猪瘟病毒感染的活性，本专利技术构建了表达萤火虫荧光素酶基因的重组猪瘟病毒CSFV-NproFluc，本专利技术将猪瘟重组病毒CSFV-NproFluc提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.9058；分类命名为：表达萤火虫荧光素酶基因的重组猪瘟病毒。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2014年04月11日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本专利技术利用所构建的表达萤火虫荧光素酶(Fluc)基因的重组猪瘟病毒评估靶向猪瘟病毒基因组Npro、P7、NS5A和NS5B基因的12条抗猪瘟病毒siRNA分子，检测结果证实，siNpro-108(SEQIDNO.1)、siNS5A-239(SEQIDNO.7)和siNS5B-1234(SEQIDNO.12)是对猪瘟病毒的干扰或抑制活性最强的siRNA分子。其中，本专利技术提供了1个靶向CSFV基因组Npro基因的具有抗猪瘟病毒活性的siRNA，其对猪瘟病毒的干扰或抑制活性较强，其核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了利用重组猪瘟病毒CSFV-NproFluc筛选出的1个靶向CSFV基因组P7基因的抗猪瘟病毒siRNA，对猪瘟病毒具有较强干扰效果，其核苷酸序列为SEQIDNO.4所示；所述siRNA是本专利技术首次公开的靶向CSFV基因组P7基因的抗猪瘟病毒siRNA。本专利技术同时利用CSFV-NproFluc及其亲本病毒Shimen株评估了筛选获得的靶向四种基因的干扰能力由强到弱的4个siRNA分子在不同本文档来自技高网...
【技术保护点】
靶向猪瘟病毒基因组P7基因的具有抗猪瘟病毒感染活性的siRNA。
【技术特征摘要】
1.靶向猪瘟病毒基因组P7基因的具有抗猪瘟病毒感染活性的siRNA。
2.按照权利要求1所述的siRNA，其特征在于：其核苷酸序列选自
SEQIDNO.4、SEQIDNO.5或SEQIDNO.6。
3.含有权利要求1或2所述具有抗猪瘟病毒感染活性的s...
【专利技术属性】
技术研发人员：仇华吉，申梁，李永锋，孙元，李素，罗玉子，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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