用双指示线免疫层析半定量诊断促黄体生成素的方法技术

本发明专利技术公开了一种生物工程技术领域的检测方法，具体是一种用双指示线免疫层析半定量诊断促黄体生成素的方法。促黄体生成素是由垂体前叶分泌的一种糖蛋白激素。促黄体生成激素(LH)是随女性月经周期而含量呈周期性变化的激素，其作用是刺激卵巢内成熟卵子的释放。动态的监测掌握LH变化特点，确定LH的峰值及时间，从而可以更准确的预测与监测排卵情况，为临床提供更准确的结果，指导育龄妇女选择最佳受孕时机或指导安全期避孕。免疫胶体金技术近年来发展迅速，得到了广泛应用，如传染病、早孕、癌症等的检测。本发明专利技术采用胶体金免疫层析法，建立快速检测LH的方法。并且能够半定量检测25～50mIU/ml这一LH灰区范围。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物工程
的检测方法，具体是一种。
技术介绍
优生优育是计划生育具体内涵的延伸，是新的历史条件下对计划生育的具体化体现。我国是人口大国，巨大的人口压力会制约着社会的发展，所以做好优生优育既是提高人口素质的重要手段，也是制约人口发展的重要手段，对未来社会整个民资的发展有重要的作用。所以大家应该要坚持做好优生优育，为子孙后代的良性发展创造有利条件。那么，在计划生育时为了优生优育应该怎样做呢？可以从优恋、优婚、优孕三个方面考虑。优恋指的是谈婚论嫁之前，要注意了解对方及其家庭成员身体健康方面的信息。优婚是指在完全知情的情况下结婚，这一点就要依赖于婚前的体检。优孕，就是在适宜的孕育年龄、最佳的受孕时机怀孕生子，这样可以最大可能的避开对胎儿发育不良的不利因素。据调查，半数以上的青年夫妇结婚以后不采取避孕措施，往往在不知不觉中怀孕。由于事先毫无计划和准备，结果有的发生了自然流产，有的感染了流感、风疹等病毒性疾病，有的使用了孕期应当禁用的药物……可见，婚后注意避孕、实行有计划的自主怀孕很有必要。促黄体生成素是由垂体前叶分泌的一种糖蛋白激素。在女性体内则主要是促进排卵的发生。促黄体生成激素(LH)是随女性月经周期而含量呈周期性变化的激素，其作用是刺激卵巢内成熟卵子的释放。通常在排卵前36 48小时左右突然大幅度上升，LH达到最高峰值后的12到18小时开始排卵，如未受孕LH迅速下降，重复下一周期。LH峰值后1_3 天时间内妇女最易受孕。因此对女体内LH的检测常被用来判断女性的排卵状况。动态的监测掌握LH变化特点，确定LH的峰值及时间，从而可以更准确的预测与监测排卵情况，为临床提供更准确的结果，指导育龄妇女选择最佳受孕时机或指导安全期避孕。开发简单、快速的促黄体生成素诊断方法具有十分重要的经济价值和社会意义。免疫胶体金技术是20世纪70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，现在已成功用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断制剂的制造等领域。目前金标记技术常与膜载体配合，形成特定的免疫检测方式，如免疫渗滤试验和免疫层析试验等。免疫层析试纸条就是此技术用于体外快速诊断的一个重要发展方向， 是在现代单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的新型检测技术。近年来该技术发展迅速，已经在临床诊断特别是床边检测(POCT)中得到了广泛应用，如传染病、早孕、癌症等的检测。利用胶体金的检测方法测定尿液中LH作为排卵的考察检测，已被开发，其检测下限为25mIU/ml。但是对于临床上单独使用25mIU/ml这一标准不能直接、快速区分排卵的强弱程度，所以开发能够检测LH 25 50mIU/ml这一 LH诊断灰区的半定量胶体金试纸也是十分必要的。目前国内外均无相关的试纸条出售。
技术实现思路
本专利技术的目的开发简单、快速的测排卵方法具有十分重要的经济价值和社会价值。本实验采用胶体金免疫层析法，建立快速检测LH的方法。并且能够半定量检测25mIU/ ml 50mIU/ml这一 LH灰区范围。本专利技术是通过以下技术方案实现的采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记β-LH抗体并均勻涂布于胶金垫上，作为示踪标记物。在硝酸纤维素膜上，两个不同浓度的α-LH抗体固定于两个检测线(即T线)，羊抗鼠二抗固定于质控线(即C线)。依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装，剪成胶体金试纸并装入检测卡中。金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色，根据T线、C线显色与否来判断阴阳性结果。本专利技术方法包括如下步骤一、胶体金溶液配制1.配制氯金酸溶液；2.配制2 %柠檬酸三钠溶液；3.将0. 02%的氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入2%的柠檬酸三钠2mL ；4.溶液由浅蓝色，深蓝，再加热出现酒红色，继续煮沸IOmin ；停止加热，继续搅拌至室温。二、胶体金标记物的制备1.取两个1. 5mL试管，分别加入ImL胶体金溶液；2.加入适量硼砂缓冲液把pH调整为8. 0 ；3.加入20 μ g/mL β -LH抗体，使其达到最小蛋白浓度，混勻，振荡30min ；4.加入 20 μ L 的 10 % BSA,混勻，振荡 30min ；5. 12000rpm离心5min，轻轻吸除上清；6.用ImL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；7.重复5.步操作；8.重复6.步操作；9.重复5.步操作；10.用fix buffer配制在MOnm处OD (光密度)值为0. 5 1. 0的胶体金免疫复合物；11.玻璃纤维素膜点样，形成胶金垫，真空冻干3小时。三、在硝酸纤维素膜上划线1. Tl线用浓度为0. 75mg/mL的a_LH抗体划线，用于检出25mIU/ml的LH ；2. T2线用浓度为0. 4mg/mL的α -LH抗体划线，用于检出50mIU/ml的LH ；3. C线用0. 75mg/mL羊抗鼠多克隆抗体划线；4.将硝酸纤维素膜置于40°C烘箱干燥3天。四、胶体金试纸条的组装1.将样品垫、胶金垫、NC膜和吸收垫4部分按顺序组装(见附图1)；2.将其组装好后用剪刀剪成4mm/条后进行检测。五、检测试纸平放，将样品加到检测条的样本垫上，由于毛细效应，液体的层析方向向前， 与固定在T线、C线上的物质发生结合被截留而显色。5min后，根据T线、C线的显色情况判定阴阳性结果。样本中的LH含量和T线的颜色呈正相关，当LH含量达到25mIU/ ml ( < 50mIU/ml)时，Tl线颜色与质控线相当或强于质控线，而T2线颜色弱于质控线(见附图2)；当LH含量达到50mIU/ml及以上时，T2线颜色与质控线相当或强于质控线，而Tl 线颜色强于质控线(见附图3)；若样本中没有LH或LH含量较低< 25mIU/ml时，则两条T 线不显色或颜色均弱于C线，为阴性(见附图4) ；T线和C线均不显色则试纸条无效。本专利技术检测对象单一且针对性强，准确率高。检测速度快，所需时间短，只需5min， 不需经培训的专业人员就可使用本专利技术方法来检测，满足医院、门诊、个人等快速、准确地检测排卵状况的要求，并且便于基层推广和运用。附图说明图1为本专利技术实施例试纸条的图示图2为本专利技术实施例试纸条的阳性结果(50mIU/ml < LH水平彡25mIU/ml)图3为本专利技术实施例试纸条的阳性结果(LH水平彡50mIU/ml)图4为本专利技术实施例试纸条的阴性结果(LH水平< 25mIU/ml)具体实施例方式下面结合附图对本专利技术的实施例作详细说明本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实例先用2%的柠檬酸三钠溶液制备20nm的金水，并标记β -LH抗体喷金标垫， α -LH抗体、羊抗鼠多克隆抗体分别包被至检测线(Τ线)、质控线(C线)，然后组装成试纸条，置37°C烘箱烘干并裁成4mm/条，室温干燥保存备用。实施例1.准备α-LH抗体、β-LH抗体。并清洗实验所需的玻璃本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：霍五奎，岳晓燕，马雪明，刘寅，王晶，罗云萍，张有青，
申请(专利权)人：正元盛邦天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：