本发明专利技术涉及一株饲用枯草芽孢杆菌的高密度生产工艺及其制备的菌剂和应用，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus?subtilis)的保藏编号为ACCC10619，其在液体深层发酵培养，经浓缩，再吸附、干燥，生产一种高浓度的枯草芽孢杆菌粉剂。生产工艺简单，工艺控制便利，生产成本低；以粉剂形式添加到饲料中，贮存、运输使用方便；货架期延长，且活性稳定，无污染，用于猪、鸡饲料，提高动物生产性能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及枯草芽孢杆菌ACCC10619高密度发酵生产的工艺，以及制备得到的菌剂和该菌剂的应用方法。
技术介绍
实践证明，随着抗生素饲料添加剂的使用，在抑制病原菌的同时，也抑制了动物消化道内的正常菌群，破坏了菌群的微生态平衡，使得致病菌大量增殖，引发二重感染或内源性感染；其次，抗生素的频繁大量使用，引起耐药菌株的产生，增加动物的易感性，造成免疫机能减退而引发胃肠道疾病及其由此造成的环境污染；此外，抗生素的残留也极大的威胁着人类健康，其防病、治病的效果越来越不理想。随着抗生素的广泛使用，其导致的耐药性和残留问题日益凸现出来，引起了科学工作者和广大消费者的共同关注。因此，各国纷纷通过立法手段禁止或限制使用抗生素，研发出能替代抗生素的新型饲料添加剂成为发展的必然趋势。微生物饲料添加剂因其安全性、无毒、无残留及有利于生态环境的可持续发展成为抗生素替代品的首选，而芽孢杆菌是微生态制剂中应用最广泛的一种微生态制剂。已有研究表明，芽孢杆菌在不利环境条件下能够以孢子形式存在，在饲料制粒、贮存及胃酸环境中仍能保持较高的活性，在改善畜禽生产性能、维持肠道菌群平衡、提高消化率等方面均有较好的效果。枯草芽孢杆菌(B. subtilis)可产生多种抗菌素及多种酶类，是目前应用较广泛的芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌可以调节动物消化道的微生态平衡、促进消化道酶的活性，以致减少有害菌群对机体的侵害、增强消化吸收。该制剂在国内外均被允许用于饲料添加剂。芽孢杆菌在液体存放时，需要添加防腐剂，且保质期短，易产生恶臭气味，在饲料加工生产中添加不方便。采用液体发酵后直接吸附干燥，需要大量吸附剂及干燥设施，生产上比较麻烦。目前，关于枯草芽孢杆菌ACCC10619的高密度生产工艺尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株饲用枯草芽孢杆菌的高密度生产工艺，以及制备得到的菌剂和该菌剂的应用方法。一株饲用枯草芽孢杆菌的高密度生产工艺，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的保藏编号为ACCC10619 ；具体包括以下步骤1)将经过斜面活化的菌株进行种子摇瓶培养，然后进行摇瓶发酵培养；所述摇瓶发酵培养条件为接种量为培养基体积的1 5%，500ml摇瓶中培养基的装量为50 200ml ；发酵温度28 ;34°C，pH值6. 8 7. 5，摇床转数180 250rpm，培养18 Mh ；所述发酵培养基由如下质量组分组成葡萄糖0. 5 0. 8 %、淀粉0. 2 0. 4 %、豆饼粉1 2 %、2. 2 4.0%硫酸锰0. 1 0. 3%、磷酸氢二钾0. 15 0. 45%、磷酸二氢钾0. 1 0.2%、硫酸镁0. 03 0. 06%、酵母粉0. 5 1. 5%、蛋白胨0. 4 0. 8%、氯化铁0. 005 0. 015%, 碳酸钙0. 05 0. 15%，补充水至100%，pH值6. 8 7. 5 ；2)发酵罐发酵条件为培养基装液量占发酵罐体积的40-70%，接种占培养基体积的1-5%的摇瓶发酵液，发酵温度^_35°C，，通气量1 0.4 0.7(1立方的发酵液每分钟通气量为0. 4 0. 7立方)，搅拌转数180 250r/min，发酵时间18 Mh。所述的摇瓶发酵培养条件优选为发酵温度30°C，pH值7. 0，摇床转数220rpm ；所述发酵培养基优选由如下质量组分组成，葡萄糖0. 5%、淀粉0. 3%、豆饼粉1. 5%,3. 08%硫酸锰0.2%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母粉1. 0 %、蛋白胨 0.5%,氯化铁0. 01 %、碳酸钙0.1%，补充水至100 %，pH值7. 0 ；发酵罐发酵条件优选为培养基装液量占发酵罐体积的50%，接种占培养基体积3%的摇瓶发酵液，接种时间18h，发酵温度30°C，通气量1 0.5，搅拌转数220r/min，发酵时间22h。所述的发酵罐发酵完成时，含菌数不低于U8X108CFU/ml。本专利技术所用的斜面活化培养基，种子摇瓶培养基，摇瓶发酵培养基和发酵罐培养基在使用之前均经过高温灭菌(12rC，30minS)。一种饲用枯草芽孢杆菌菌剂，是将上述的生产工艺中发酵罐发酵得到的枯草芽孢杆菌发酵液离心，收集菌泥；将菌泥与麦麸混合吸附，吸附后干燥，粉碎制备而成。具体是将所述的发酵罐发酵得到的枯草芽孢杆菌发酵液在离心机3000 5000rpm高速离心10 20min,收集菌泥；将菌泥与麦麸按1 10 100质量比吸附，吸附后60 80°C干燥1 他，粉碎到不小于60目制备而成。优选将所述枯草芽孢杆菌发酵液在离心机4000rpm高速离心15min，收集菌泥，将菌泥与麦麸按1 10质量比吸附，吸附后60°C干燥lh，粉碎。上述的饲用枯草芽孢杆菌菌剂用于制备抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌的制剂。具体是将菌剂添加到饮水或饲料中。所述的菌剂在养殖动物饲料中添加量满足含菌数为IO8 101(lCFU/kg(优选101(lCFU/kg)饲料。所述养殖动物为猪或鸡。本专利技术枯草芽孢杆菌ACCC10619斜面活化(培养基牛肉膏0.3 0.5%，氯化钠0. 5 1. 0%，蛋白胨0. 5 1. 0%，补充水至100% ;pH 6. 8 7. 5，置于30 34°C生化培养箱培养18 Mh)，接种一接种环到IOOml种子液中，进行种子摇瓶培养，温度30°C，摇床转数220r/min,时间18 24h。种子摇瓶培养基为牛肉膏0. 3 0. 5 %，氯化钠0. 5 1. 0 %，蛋白胨0. 5 1. 0 %， 水加至 100% ；pH 6. 8 7. 5优选地，种子摇瓶培养基为牛肉膏0. 3 %，氯化钠0. 5 %，蛋白胨1. 0 %，水加至 100% ；pH 7. 0。本专利技术枯草芽孢杆菌ACCC10619益生性的检验方法如下采用牛津杯法对抑菌试验菌株的效果进行检测。在直径9cm的灭菌平皿中，注入 15ml灭菌好的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，使其冷却凝固，作为底层。分别在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，接种活化好的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌等G种指示菌)，于恒温培养箱37°C培养Mh，采用平板活菌计数法进行活菌计数后，将指示菌液进行10倍梯度稀释，自稀释度为10_6 10_7的指示菌稀释液中，分别取0. 2ml指示菌悬液加入培养基中，摇勻，另加入5ml放冷至50°C的培养基，在底层上均勻混合，作为菌层，置于37°C干燥冷却30min，待其充分凝固。在无菌条件下，分别将灭菌后的不锈钢牛津杯(外径8mm，内径6mm)放置于培养基表面，每个培养基平板中等距放置3个牛津杯，用无菌移液管分别吸取等量上述试验培养好的试验菌菌液，加满牛津杯，每个试验菌做3个重复，于37。C恒温培养箱中培养Mh，用游标卡尺准确测量抑菌圈的直径，计算其平均值。 抑菌圈的大小与抑菌活性的强弱呈正相关，根据形成抑菌圈的大小可以判断试验菌抑菌活性的强弱，检测不同指示菌对抑菌物质的敏感性。有结果可知，枯草芽孢杆菌ACCC10619对大肠杆菌的抑菌圈直径为15. 77mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为15. 37mm，对副伤寒沙门氏菌的抑菌圈直径为12. 90mm，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周映华，刘惠知，吴胜莲，曾艳，胡新旭，高书锋，汪彬，周小玲，缪东，
申请(专利权)人：湖南省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。