【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术与环境保护领域，涉及生物发酵处理养殖排泄物污染及有机废弃物资源化利用、微生物降解抗生素与农药残留进行农业生态环境修复，具体涉及一种降解抗生素与农药残留的复合微生物菌剂及其制备与应用。
技术介绍
随着我国养殖业的规模化与工厂化，养殖过程中动物疾病多发，为防治动物疾病，各种化学药物、疫苗、抗生素等在动物养殖过程中被大量使用，导致药物直接进入动物体内，大部分药物通过粪便尿液排泄，在粪便尿液中形成高浓度的抗菌药物残留。按照现有养殖业粪污处理技术，对畜禽粪污排泄物的处理方式分为两种：第一种是自然堆沤发酵形成堆肥，这种方式的缺陷是周期长、环境污染严重、肥效低、容易形成二次污染；第二种方式是将微生物发酵剂接种至排泄物中，将其发酵腐熟后制作有机肥。第二种处理方式虽然可通过腐熟除臭实现了有机质还田，但残留在有机物中的抗生素与其他化学药物未被分解，通过这种方式获得的有机肥施入农田后没有被降解的抗生素与化学药物残留物依然会破坏土壤中有益微生物菌落平衡，使得植物抗病虫害能力弱化，是农业生态环境中的潜在威胁与污染。在现代农业种植中，为防治作物病虫害，提高产量，化肥农药普遍过量使用。很多农药喷施到农田后，只有5%左右的农药到达目标害虫，而95%的农药仍残留在水体、土壤和农业生态系统中，它会通过食物链的富集，最终进入到生物体内，严重影响人类的身体健康。要解决这些污染，最有效的办法就是利用微生物进行降解。但现有的农业复合微生物菌剂按其功效主要分为两种类型：一种是发酵处理畜禽粪污及有机物料，腐熟后肥料化利用；一种是作为功能性生物肥料或者生物农药使用。这两种类型的复合...
【技术保护点】
一种降解抗生素与农药残留的复合微生物菌剂，其特征在于：该复合微生物菌剂是通过菌种筛选与培养条件优化、菌种活化、扩大培养、脱水干燥步骤，分别获得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、胶质芽孢杆菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌10种菌种的菌体干粉，将10种菌种的菌体干粉混合均匀，得到的多菌体复合菌粉。
【技术特征摘要】
1.一种降解抗生素与农药残留的复合微生物菌剂，其特征在于：该复合微生物菌剂是通过菌种筛选与培养条件优化、菌种活化、扩大培养、脱水干燥步骤，分别获得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、胶质芽孢杆菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌10种菌种的菌体干粉，将10种菌种的菌体干粉混合均匀，得到的多菌体复合菌粉。2.如权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：（1）将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、胶质芽孢杆菌、嗜热球菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌10种菌株分别进行菌株的筛选与培养条件优化，获得纯化菌株；将纯化菌株分别进行高密度培养、接种到摇瓶中活化培养、将活化培养好的菌种接种到发酵罐进行扩大培养；扩大培养结束后，将分别扩大培养得到的单菌种的发酵菌液经脱水干燥，获得上述10种菌种的菌体干粉；（2）将10种菌株的菌体干粉均匀混合，得到多菌体复合菌粉；所述多菌体复合菌粉中，各活体菌占复合菌粉活菌总数的重量百分比如下：枯草芽孢杆菌10-15%、黑曲霉10-15%、胶质芽孢杆菌10-15%、粪肠球菌10-15%、地衣芽孢杆菌8-12%、巨大芽孢杆菌8-12%、荧光假单胞菌8-12%、植物乳杆菌5-8%、多粘芽孢杆菌5-8%、嗜热链球菌6-8%；所述多菌体复合菌粉中，有效活性菌含量为200-500亿个cfu/g，水分含量≦5%；在多菌体复合菌粉通入无菌空气包装，即得复合微生物菌剂。3.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂，其特征在于：由枯草芽孢杆菌菌株制备枯草芽孢杆菌菌体干粉的具体步骤如下：（1）枯草芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化：1）筛选培养基配方及制备：按以下培养基配方：葡萄糖18-20g/L、蛋白胨15-18g/L、氯化钠5-6g/L、牛肉膏0.5-1g/L、琼脂15-20g/L、MnSO4.7H2O0.015-0.02g/L，补充成分：DDT0.1-0.2g/L，pH7.0-7.2，将MnSO4.7H2O、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、葡萄糖、DDT、琼脂溶解于1000mL蒸馏水中，加热煮溶，并在121℃高压蒸汽灭菌15min，得基础培养基，待基础培养基冷却至45℃~50℃时，加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分，与尚处于融溶状态的基础培养基混合，然后倾注到灭菌平板上，平板上培养基厚度至少高5mm，培养基的最终pH在温度为25℃时，为7.2-7.5，得含有DDT的固体培养基平板，置于黑暗处，于3℃~6℃保存；2）接种与纯化：将安瓿管保存的普通枯草芽孢杆菌制成菌液，涂布于含有DDT的固体培养基平板上，置于35℃-38℃条件下遮光培养2-3天，得到不同菌落；3）将步骤2）分离得到的菌落，在含有甲胺磷的固体培养基平板上划线，进一步分离和纯化；此步骤重复3-5次，直至得到单一菌落；4）将步骤3）的单一菌落依次接入含有DDT的液体培养基中，置于35℃-38℃，180-200r/min振荡条件下，培养1-3天，得到单一菌落培养液；5）将步骤4）得到的培养液，在DDT浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线，37-39℃避光培养2-3天；在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解DDT的菌株；6）将步骤5）得到菌株，分别转接到活化培养基上进行活化；然后将活化的菌液按2-3%的接种量，转接到含有DDT的液体培养基中，35℃-37℃，220-250r/min振荡培养1-3天，最后用高效液相色谱法测定菌株对DDT的降解率；7）筛选得到对DDT降解率最高的枯草芽孢杆菌，作为纯化菌株采用试管斜面保存，置于冰箱4℃储存；（2）枯草芽孢杆菌菌种活化：将步骤7）筛选得到的、置于冰箱4℃储存的枯草芽孢杆菌接种到活化培养摇瓶中，以摇瓶转速为160-200r/min，在35-37℃温度下培养26h-32h，获得液体发酵种子；上述活化培养的活化培养基配方为：蛋白胨9.25-11.25g/L、牛肉膏1.25-1.3g/L、NaCl32.5-5.5g/L、葡萄糖22-25g/L，营养液pH7.5-7.8；（3）枯草芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥：将步骤（2）获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵，进行扩大培养，接种量2-5%；扩大培养的培养基配方为：玉米粉18-20g/L、豆粉20-22g/L、鱼粉5-6g/L、K2HPO41.2-1.5g/L、MgSO4.7H2O0.15-0.2g/L、碳酸钙6.5-8.0g/L、硫酸铵1.5-1.65g/L；发酵罐中温度控制在37-40℃，发酵pH7-8，搅拌速度为200-250r/min，发酵时间28-32h；当发酵罐中的枯草芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时，将发酵好的枯草芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成枯草芽孢杆菌菌体干粉。4.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂，其特征在于：由地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）菌株制备地衣芽孢杆菌菌体干粉的具体步骤如下：（1）地衣芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化：1）筛选培养基配方及制备：按以下培养基配方：MnSO40.5-1.0g/L、蛋白胨8-10g/L、牛肉膏2-3g/L、NaCl3-5g/L、葡萄糖1.5-2.5g/L、琼脂15-20g/L，补充成分：甲胺磷0.15-0.25g/L，pH7.0-7.2，将MnSO4、蛋白胨、牛肉膏、NaCl、葡萄糖、甲胺磷、琼脂溶解于1000mL蒸馏水中，加热煮溶，并在121℃高压蒸汽灭菌15min，得基础培养基，待基础培养基冷却至45℃~50℃时，加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分，与尚处于融溶状态的基础培养基混合，倾注到灭菌平板上，培养基厚度至少高5mm，培养基的最终pH在温度为25℃时，为7.0-7.2，得含有甲胺磷的固体培养基平板，置于黑暗处，于3℃~6℃保存；2）接种与纯化：将安瓿管保存的普通地衣芽孢杆菌制成菌液，涂布于含有甲胺磷的固体培养基平板上，置于30℃-32℃条件下遮光培养2-3天，得到不同菌落；3）将步骤2）分离得到的菌落，在含有甲胺磷的固体培养基平板上划线，进一步分离和纯化；此步骤重复3-5次，直至得到单一菌落；4）将步骤3）的单一菌落依次接入含有甲胺磷的液体培养基中，置于30℃-32℃，160-180r/min振荡条件下，培养1-3天，得到单一菌落培养液；5）将步骤4）得到的培养液，在甲胺磷浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线，30-32℃避光培养2-3天；在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解甲胺磷的菌株；6）将步骤5）能够降解甲胺磷的菌株，分别转接到活化培养基上进行活化；然后将活化的菌液按3%-5%的接种量，转接到含有甲胺磷的液体培养基中，30℃-32℃，200-220r/min振荡培养1-3天，最后用高效液相色谱法测定各菌株对甲胺磷的降解率；7）筛选得到对甲胺磷降解率最高的地衣芽孢杆菌菌株，作为纯化菌株采用试管斜面保存，置于冰箱4℃储存；（2）地衣芽孢杆菌菌种活化：将步骤7）筛选得到的、置于冰箱4℃储存的地衣芽孢杆菌斜面菌种接种到活化培养摇瓶中，以摇瓶转速160r/min，在28-30℃温度下培养16h-20h，获得液体发酵种子；所述活化培养的活化培养基配方为：蛋白胨9.25-10.0g/L、牛肉膏4.5-5g/L、NaCl4.8-5.0g/L、葡萄糖1.5g-2.0/L、营养液pH6.5-7.2；（3）地衣芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥：将步骤（2）获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵，进行扩大培养，接种量为3-5%；扩大培养基配方为：玉米粉15-18g/L、豆粉22-25g/L、K2HPO40.08-0.20g/L、MgSO4.7H2O0.005-0.01g/L、酵母粉0.1-0.15g/L；发酵温度25-40℃，发酵pH值6-8，搅拌速度为200-300r/min，空气流量比为8-10%，发酵时间18-28h；当发酵罐中的地衣芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时，将发酵好的地衣芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成地衣芽孢杆菌菌体干粉。5.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂，其特征在于：由黑曲霉菌株制备黑曲霉菌体干粉的具体步骤如下：（1）黑曲霉菌株的筛选与培养条件优化：1）筛选培养基配方及制备：按以下培养基配方：蛋白胨5-10g/L、葡萄糖20-25g/L、硫酸镁0.5-1.0g/L、酵母浸出粉2.0-3.0g/L、磷酸氢二钾1.0-2.0g/L、琼脂15-20g/L，补充成分：草甘膦0.15-0.25g/L、百草枯0.2-0.5g/L、土霉素0.1-0.2g/L，将蛋白胨、葡萄糖、硫酸镁、酵母浸出粉、磷酸氢二钾、琼脂溶解于1000mL蒸馏水中，然后加入10mL甘油，加热煮溶，并在121℃高压蒸汽灭菌15min，得基础培养基，待基础培养基冷却至45℃~50℃时，加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分草甘膦、百草枯、土霉素，与尚处于融溶状态的基础培养基混合，倾注到灭菌平板上，培养基厚度至少高5mm，培养基的最终pH在温度为25℃时，为6.5-6.8，得含有草甘膦、百草枯的固体培养基平板，置于黑暗处，于3℃~6℃保存；2）接种与纯化：将安瓿管保存的普通黑曲霉菌制成菌液，涂布于含有草甘膦、百草枯的固体培养基平板上，置于28℃-30℃条件下遮光培养2-3天，得到不同菌落；3）将步骤2）分离得到的各菌落，在含有草甘膦、百草枯的固体培养基平板上划线，进一步分离和纯化；此步骤重复3-5次，直至得到单一菌落；4）将步骤3）的单一菌落依次接入含有草甘膦、百草枯的液体培养基中，置于30℃-32℃120-150r/min振荡条件下，遮光培养1-3天，得到单一菌落培养液；5）将步骤4）得到的培养液，在草甘膦、百草枯浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线，30-32℃避光培养2-5天；在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解草甘膦、百草枯的菌株；6）将步骤5）得到能够降解草甘膦、百草枯的菌株，分别转接到活化培养基上进行活化；然后将活化的菌液按1-3%的接种量，转接到有草甘膦、百草枯液体培养基中，25℃-28℃，160-180r/min振荡暗培养1-3天，最后用高效液相色谱法测定菌株对除草剂草甘膦、百草枯的降解率；7）筛选得到对除草剂草甘膦、百草枯的降解率最高的黑曲霉菌菌株，作为纯化菌株采用试管斜面保存，置于冰箱4℃储存；（2）黑曲霉菌种活化：将步骤7）置于冰箱4℃储存的黑曲霉接种到活化培养摇瓶中活化，活化培养基配方为蛋白胨5.0-5.5g/L、葡萄糖10.0-15g/L、硫酸镁0.5-0.8g/L、酵母浸出粉2.0-3.0g/L、磷酸氢二钾1-3g/L，营养液pH7.0-7.2，摇瓶转速为100-160r/min，在28-35℃温度下培养25h-28h，获得液体发酵种子；（3）黑曲霉扩大培养、脱水干燥：将步骤（2）获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵，进行扩大培养，接种量8-10%；扩大培养基配方马铃薯35-40g/L、葡萄糖20-50g/L、磷酸氢二钾5-8g/L、硫酸镁1-1.5g/L、pH值为7.0；发酵温度为35℃，搅拌速度100-180r/min，发酵时间25-28h，当发酵罐中的黑曲霉含量达到≧1010个/ml时，将发酵好的黑曲霉菌液经干燥脱水制备成黑曲霉菌体干粉。6.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂，其特征在于：由胶质芽孢杆菌（BacillusmucilaginosusKrassilnikov）菌株制备胶质芽孢杆菌菌体干粉的具体步骤如下：（1）胶质芽孢杆菌菌株的筛选与培养条件优化，按常规方法进行：1）筛选培养基配方及制备：按以下培养基配方：葡萄糖2-3g/L、硫酸铵0.15-0.25g/L、酵母膏0.1-0.g/L、KCl0.01-0.02g/L、MgSO4.7H2O0.01-0.02g/L、NaH2PO40.01-0.02g/L、CaCO30.1-0.2g/L、二氧化硅1-2g/L、琼脂10-15g/L，补充成分：氯氰菊脂0.1-0.3g/L、CuSO4.5H2O0.02-0.025g/L，起始pH7.0-7.2；将葡萄糖、硫酸铵、酵母膏、KCl、MgSO4.7H2O、NaH2PO4、CaCO3、二氧化硅、CuSO4.5H2O、琼脂溶解于1000mL蒸馏水中，加热煮溶，并在121℃高压蒸汽灭菌15min，得基础培养基，待基础培养基冷却至45℃~50℃时，加入溶于2mL灭菌蒸馏水的补充成分氯氰菊脂，与尚处于融溶状态的基础培养基混合，倾注到灭菌平板上，培养基厚度至少高5mm，培养基的最终pH在温度为25℃时，为7.0-7.5，得有氯氰菊脂及硫酸铜的固体培养基平板，置于黑暗处，于3℃~6℃保存；2）接种与纯化：将安瓿管保存的普通胶质芽孢杆菌制成菌液，涂布于含有氯氰菊脂及硫酸铜的固体培养基平板上，置于28℃-30℃条件下遮光培养2-3天，得到不同菌落；3）将步骤2）分离得到的菌落，在含有对硫磷的固体培养基平板上划线，进一步分离和纯化；此步骤重复3-5次，直至得到单一菌落；4）将步骤3）的单一菌落依次接入含有对硫磷的液体培养基中，置于28℃-30℃，180-200r/min振荡条件下，培养1-3天，得到单一菌落培养液；5）将步骤4）得到的培养液，在氯氰菊脂浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线，32-35℃避光培养2-3天；在培养基平板上能够生长的菌株即为能够降解氯氰菊脂的菌株；6）将步骤5）得到能够降解氯氰菊脂的菌株，分别转接到活化培养基上进行活化；然后将活化的菌液按2-5%的接种量，转接到有氯氰菊脂液体培养基中，37℃-40℃，200-220r/min振荡培养1-3天，最后用高效液相色谱法测定菌株对氯氰菊脂的降解率；7）筛选得到对氯氰菊脂的降解率最高的胶质芽孢杆菌菌株，作为纯化菌株采用试管斜面保存，置于冰箱4℃储存；（2）胶质芽孢杆菌菌种活化：将步骤7）获得的、置于冰箱4℃储存的胶质芽孢杆菌接种到活化培养摇瓶中活化，活化培养基配方为：淀粉15-20g/L、磷酸氢二钾g/L、硫酸铵2-3g/L、酵母膏3.5-5.5g/L、蔗糖8.5-10g/L、硫酸镁4.5-5g/L、碳酸钙2.5-3g/L、二氧化硅6.5-8g/L、三氯化铁0.05-lg/L，pH7.0-7.2，摇瓶转速为180-200r/min，在30-35℃温度下培养18-20h，获得液体发酵种子；（3）胶质芽孢杆菌扩大培养、脱水干燥：将步骤（2）获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵，进行扩大培养，接种量为4-6%；发酵培养基的成分为蔗糖2.5-6.5gg/L、磷酸氢二钾3-5.5gg/L、酵母膏3-6g/L、硫酸铵2.5-5gg/L、大豆蛋白胨5-10g/L、硫酸镁3-6/g/L、pH7.2-7.5；扩大培养条件：发酵温度32℃，pH7.2，搅拌速度180r/min-220r/min，发酵时间24h；当发酵罐的胶质芽孢杆菌含量达到≧1010个/ml时，将发酵好的胶质芽孢杆菌菌液经干燥脱水制备成胶质芽孢杆菌菌体干粉。7.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂，其特征在于：由嗜热链球菌菌株制备嗜热链球菌菌体干粉的具体步骤如下：（1）嗜热链球菌菌株的筛选与培养条件优化按常规方法进行：1）筛选培养基配方及制备：按以下培养基配方：水100ml、牛肉膏2-3g/L、蛋白胨2-3g/L、酵母膏1-2g/L、番茄汁15-20g/L、葡萄糖2-4g/L、吐温0.5ml-1.0ml/L、碳酸钙1.0-2.0g/L、琼脂2-5g/L，pH6.5-7.0，依照比例取适量水于锅中，加热，将牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、番茄汁、葡萄糖、吐温、碳酸钙依次加入水中，待锅中药品沸腾后倒入加了琼脂的锥形瓶中加塞、包扎，121℃灭菌20min，得灭菌后的培养基，放在37℃恒温培养箱培养24h，无菌生长者方可使用；所述培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基，用于菌类的振荡培养；所述番茄汁可利用新鲜的番茄压榨而成；2）接种与纯化：将安瓿管保存的普通嗜热链球菌制成菌液，涂布于固体培养基平板上，置于37℃-38℃条件下遮光培养2-3天，得到不同菌落；3）将步骤2）分离得到的菌落，在固体培养基平板上划线，进一步分离和纯化；此步骤重复3-5次，直至得到单一菌落；4）将步骤3）的单一菌落依次接入液体培养基中，静置于36℃-38℃，培养1-3天，得到单一菌落培养液；5）将步骤4）得到的培养液，在固体培养基平板上划线，37-38℃避光培养2-3天；在固体培养基平板上培养得到菌株；6）将步骤5）得到各菌株，分别转接到活化培养基上进行活化，然后将活化的菌液按5%-8%的接种量，转接到液体培养基中，37℃，静置培养1-2天，测定各菌株所产生的生物活性物质含量；7）筛选得到产生生物活性物质含量最高的嗜热链球菌菌株，作为纯化菌株采用试管斜面保存，置于冰箱4℃储存；（2）嗜热链球菌菌种活化：将步骤7）获得的、置于冰箱4℃储存的嗜热链球菌接种到活化培养摇瓶中活化培养，活化培养基配方为：胰蛋白胨1-3.0g/L、鱼蛋白胨2-3g/L、牛肉膏2-3g/L、酵母膏0.5-1.5g/L、硫酸镁0.3-0.5g/L、磷酸二氢钾0.5-1.0g/L、乳糖1-1.5g/L，营养液pH6.5-6.8，在35-40℃温度下培养24h-28h，搅拌速度为80-100r/min，获得液体发酵种子；（3）嗜热链球菌扩大培养、脱水干燥：将步骤（2）获得液体发酵种子接种到扩大培养的发酵罐中发酵，进行扩大培养，接种量2-5%；扩大培养基配方：葡萄糖1-3g/L、大豆蛋白胨4-6g/L、磷酸氢二钾2-3g/L、玉米汁40-50g/L、醋酸钠1-2g/L、脱脂乳10-15g/L、pH为6.5-6.8；发酵温度38-45℃，搅拌速度为100-120r/min，发酵...
【专利技术属性】
技术研发人员：何圣平，凌仕信，
申请(专利权)人：中山市润泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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