一种高效生物转化制备11α,17α-二羟基黄体酮的方法技术

本发明专利技术提供了一种高效生物转化制备11α,17α-二羟基黄体酮的方法。该方法以17α-羟基黄体酮为原料，通过在生物转化过程中补加碳源，从而为菌体生长提供充足的碳源，使菌丝体内羟化酶保持高活力，延长菌体高效生物转化稳定期，使得发酵培养基中17α-羟基黄体酮投料量可以高于2％(w/v)，制备的11α，17α-二羟基黄体酮的转化得率达到90％以上。发酵培养基中17α-羟基黄体酮最佳投料比范围为2-20％，11α,17α-二羟基黄体酮的转化得率最高可达到98％。有效地解决了反应物投料比低导致的设备产出率低、污染物排放量大等问题，提高了产出效率，降低了生产成本。

Method for preparing 11 alpha and 17 alpha - two hydroxy progesterone efficiently by biotransformation

The present invention provides a method for efficiently preparing 11 alpha, 17 alpha - two hydroxy progesterone. This method takes 17 alpha hydroxy ketone as raw material, by adding carbon sources in the bioconversion process, so as to provide sufficient carbon source for cell growth, to maintain high activity in the mycelium of hydroxylase was lengthened, efficient biotransformation stable, making fermentation medium 17 alpha hydroxy progesterone dosage can be higher than 2% (w/v), the preparation of the 11 alpha 17, alpha two hydroxy progesterone conversion rate reached more than 90%. In the fermentation medium, the optimum feeding range of 17 alpha hydroxy progesterone was 2-20%, 11 alpha, and 17, two - hydroxy progesterone, the highest conversion rate was 98%. The utility model effectively solves the problems of low output rate of equipment and large pollutant emission caused by low feed ratio of reactants, thereby improving output efficiency and reducing production cost.

【技术实现步骤摘要】
一种高效生物转化制备11α,17α-二羟基黄体酮的方法
本专利技术属于甾族化合物的制备领域，涉及一种生物转化制备11α,17α-二羟基黄体酮的方法，特别是涉及一种高效生物转化制备11α,17α-二羟基黄体酮的方法。
技术介绍
11α,17α-二羟基黄体酮(简称双羟黄体酮)，是一种重要的皮质激素类药物中间体，用于皮质类激素药物的合成，是生产氢化可的松、地塞米松、泼尼松、倍他米松等甾体激素类药物的重要中间体。17α-羟基黄体酮，全名17α-羟基-孕甾-4烯-3,20-二酮，又称羟孕酮，是一种无臭、白色或类白色结晶性粉末，难溶于水，可溶于部分有机溶剂如甲醇、乙腈、氯仿、丙酮等。由17α-羟基黄体酮转化为11α,17α-二羟基黄体酮的分子结构为：甾体的C11羟基化是各种皮质激素合成不可缺少的一步。1952年Peterson和Murray最早用黑根霉(Rhizopusnigricans)对孕酮C11位进行羟基化，并成功将黄体酮一步转化成11α-羟基黄体酮，使孕酮到皮质酮的过程减少到只需3步，解决了皮质激素合成过程中的关键问题。甾体上羟基对于化学合成来说非常困难，除了甾体的C17位上易引入一个羟基外，其他位置都很难以化学方法引入羟基。甾体C11羟基化是微生物特有的转化反应，近年来，以17α-羟基黄体酮为原料，采用生物转化方法制备11α,17α-二羟基黄体酮已实现了产业化。该方法不单解决了11α,17α-二羟基黄体酮难以化学合成的问题，而且在11位引入羟基增加了皮质激素类化合物的药效，为甾族类化合物羟基化提供了一条新途径。但是甾体化合物水溶性差，溶解度一般为10-6～10-5mol/L，在生物转化过程中传质效率低，限制了反应物投料比，在文献报道的以17α-羟基黄体酮为原料生物转化制备11α,17α-二羟基黄体酮过程中，反应物17α-羟基黄体酮的投料质量比均低于2％。由于反应物17α-羟基黄体酮的投料质量比低，导致产出效率低，培养基利用率低，污染物排放量大。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种生物转化制备11α,17α-二羟基黄体酮的方法，尤其是提供一种高效生物转化制备11α,17α-二羟基黄体酮的方法。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种生物转化制备11α,17α-二羟基黄体酮的方法，所述方法包括以下步骤：(1)斜面制备：将赭曲霉菌种接种于斜面培养基，恒温培养，生成黄色孢子斜面，备用；(2)种子培养：从步骤(1)得到的黄色孢子斜面上取菌种接种于种子培养基中进行种子培养得到种子液；(3)生物转化：将步骤(2)所得种子液接种至发酵培养基中，同时加入反应物17α-羟基黄体酮，振荡培养，振荡培养过程中，补加碳源和反应物17α-羟基黄体酮，保持碳源在发酵液中的浓度不低于0.8mg/mL，17α-羟基黄体酮总的投料量为发酵培养基体积的2-20％，获得11α,17α-二羟基黄体酮的发酵液。11α,17α-二羟基黄体酮的生物转化制备过程是发酵菌体中的羟化酶催化过程，菌体生长旺盛则羟化酶催化活力高，保持菌体催化活力是提高转化效率的关键。本专利技术通过在生物转化过程中补加碳源，保持碳源在发酵液中的浓度不低于0.8mg/mL，从而为菌体生长提供充足的碳源，使菌丝体内羟化酶保持高活力，延长了菌体高效生物转化稳定期，因此可以在高反应物投料量下实现对17α-羟基黄体酮的高效生物转化，提高了产出效率，降低了生产成本和污染物排放总量。在本专利技术所述方法中，步骤(1)所述斜面培养基中包含质量体积比(w/v)如下的组分：葡萄糖2.0-5.0％、麦芽膏1.0-5.0％、蛋白胨0.5-3.0％、琼脂2.0-2.5％，所述斜面培养基的pH值5.0-6.0，经蒸汽灭菌后使用。步骤(1)中所述质量体积比是指相对于100mL培养基中加入的组分的质量(g)，例如斜面培养基中包含葡萄糖2.0-5.0％，即指在100mL斜面培养基中含有2.0-5.0g的葡萄糖。下文中对于种子培养基中以及发酵培养基中各成分的质量体积比的含义与此处均相同。在斜面培养基中，葡萄糖的含量可以为2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3％、3.2％、3.5％、3.8％、4％、4.2％、4.4％、4.6％或4.8％；麦芽膏的含量可以为1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、2.3％、2.5％、2.8％、3％、3.3％、3.5％、3.8％、4％、4.3％、4.5％或4.8％；蛋白胨的含量可以为0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、2.3％、2.5％或2.8％；琼脂的含量可以为2.1％、2.15％、2.2％、2.25％、2.3％、2.35％、2.4％、2.45％。本专利技术所述斜面培养基的pH值为5.0-6.0，例如5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8或5.9，所述斜面培养基经121℃蒸汽灭菌20min后方可使用。优选地，步骤(1)所述恒温培养的温度为25-28℃，例如25.5℃、26℃、26.5℃、27℃或27.5℃。优选地，步骤(1)所述恒温培养的时间为4-7天，例如4.3天、4.5天、4.8天、5天、5.3天、5.5天、5.8天、6天、6.3天、6.5天或6.8天。步骤(1)得到的黄色孢子斜面可以在冰箱4℃下恒温保存备用，可保存2-3个月。在本专利技术所述方法中，步骤(2)所述种子培养基中包含质量体积比(w/v)如下的组分：葡萄糖2.0-5.0％、玉米浆1.0-5.0％、蛋白胨1.0-5.0％和酵母膏0.5-2.0％，所述种子培养基的pH值为5.5-6.5，经蒸汽灭菌后使用。在种子培养基中，葡萄糖的含量可以为2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3％、3.2％、3.5％、3.8％、4％、4.2％、4.4％、4.6％或4.8％；玉米浆的含量可以为1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、2.3％、2.5％、2.8％、3％、3.3％、3.5％、3.8％、4％、4.3％、4.5％或4.8％；蛋白胨的含量可以为1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、2.3％、2.5％、2.8％、3％、3.3％、3.5％、3.8％、4％、4.3％、4.5％或4.8％；酵母膏的含量可以为0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％或1.9％。种子培养基的pH值为5.5-6.5，例如5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3或6.4。所述种子培养基经121℃蒸汽灭菌20min后方可使用。优选地，步骤(2)所述种子培养为在160-220r/min(例如160r/min、165r/min、170r/min、175r/min、180r/min、185r/min、190r/min、195r/min、200r/min或220r/min)下进行振荡培养。优选地，步骤(2)所述种子培养的温度为25-32℃，例如26℃、27℃、28℃、29℃、30℃或31℃。优选地，步骤(2)所述种子培养的时间为20-30h，例如21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h或29h。在本专利技术所述方法中，步骤(3)所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物转化制备11α,17α‑二羟基黄体酮的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)斜面制备：将赭曲霉菌种接种于斜面培养基，恒温培养，生成黄色孢子斜面，备用；(2)种子培养：从步骤(1)得到的黄色孢子斜面上取菌种接种于种子培养基中进行种子培养得到种子液；(3)生物转化：将步骤(2)所得种子液接种至发酵培养基中，同时加入反应物17α‑羟基黄体酮，振荡培养，振荡培养过程中，补加碳源以及补加反应物17α‑羟基黄体酮，保持碳源在发酵液中的浓度不低于0.8mg/mL，17α‑羟基黄体酮总的投料量为发酵培养基体积的2‑20％，获得11α,17α‑二羟基黄体酮的发酵液。

【技术特征摘要】
1.一种生物转化制备11α,17α-二羟基黄体酮的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)斜面制备：将赭曲霉菌种接种于斜面培养基，恒温培养，生成黄色孢子斜面，备用；(2)种子培养：从步骤(1)得到的黄色孢子斜面上取菌种接种于种子培养基中进行种子培养得到种子液；(3)生物转化：将步骤(2)所得种子液接种至发酵培养基中，同时加入反应物17α-羟基黄体酮，振荡培养，振荡培养过程中，补加碳源以及补加反应物17α-羟基黄体酮，保持碳源在发酵液中的浓度不低于0.8mg/mL，17α-羟基黄体酮总的投料量为发酵培养基体积的2-20％，获得11α,17α-二羟基黄体酮的发酵液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述斜面培养基中包含质量体积比(w/v)如下的组分：葡萄糖2.0-5.0％、麦芽膏1.0-5.0％、蛋白胨0.5-3.0％和琼脂2.0-2.5％，所述斜面培养基的pH值为5.0-6.0，经蒸汽灭菌后使用；优选地，步骤(1)所述恒温培养的温度为25-28℃；优选地，步骤(1)所述恒温培养的时间为4-7天。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述种子培养基中包含质量体积比(w/v)如下的组分：葡萄糖2.0-5.0％、玉米浆1.0-5.0％、蛋白胨1.0-5.0％和酵母膏0.5-2.0％，所述种子培养基的pH值为5.5-6.5，经蒸汽灭菌后使用；优选地，步骤(2)所述种子培养为在160-220r/min下进行振荡培养；优选地，步骤(2)所述种子培养的温度为25-32℃；优选地，步骤(2)所述种子培养的时间为20-30h。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述发酵培养基中包含质量体积比(w/v)如下的组分：葡萄糖1.0-4.0％、玉米浆0.5-4.0％、蛋白胨0.5-4.0％和酵母膏0.5-3.0％，所述发酵培养基的pH值为5.5-6.5，经蒸汽灭菌后使用。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘庆芬，贾慧敏，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11