一种β-伴大豆球蛋白单克隆抗体制备方法技术

本发明专利技术涉及一种β-伴大豆球蛋白单克隆抗体制备方法。本发明专利技术方法首先采用化学法或基因工程技术制备含β-伴大豆球蛋白α亚基IgE抗原表位的表位小肽，然后将表位小肽耦联到载体蛋白或载体多肽上免疫动物，取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经克隆、筛选获得分泌β-伴大豆球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，采用细胞培养和腹水法制备β-伴大豆球蛋白单克隆抗体。本发明专利技术制备的单克隆抗体，针对β-伴大豆球蛋白中的过敏表位，特异性强，明显优于现有技术制备的抗体，在大豆品种选育与改良、β-伴大豆球蛋白分离纯化与检测、β-伴大豆球蛋白致敏机理研究等领域具有广泛用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，涉及。
技术介绍
大豆及其制品含有丰富的蛋白质和平衡的氨基酸，是人和畜禽优质的植物性蛋白源。但大豆中含有胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素、致敏原、低聚糖、植酸、脲酶及致甲状腺肿素等抗营养因子，干扰人和动物肠道内营养物质的消化吸收，破坏正常的新陈代谢，诱发过敏反应(尤其是婴幼儿及幼龄畜禽)，在很大程度上限制了其在食品和饲料行业尤其是婴幼儿食品及幼龄畜禽饲料中的应用。胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素等抗营养因子热稳定性较差，可以通过高温处理消除。大豆中的致敏原主要包括大豆球蛋白(glycinin) 禾口三禾中伴大豆球蛋白(α -conglycinin、β -conglycinin 禾口 γ -conglycinin),其中 β -conglycinin是免疫原性最强的致敏原，其热稳定性较高，常规加工处理方法很难消除。 大豆与牛奶、鸡蛋、鱼、贝类、小麦、花生、坚果被列为最易引起人类过敏的8种食物。在养猪生产中，仔猪断奶前后连续饲喂含大豆蛋白日粮，会引起过敏反应，致肠粘膜受损，肠绒毛脱落，隐窝加深，肠壁通透性增加，肥大细胞数量和组胺释放量增加，进而导致腹泻、生长受阻。人们一直在探索消减大豆蛋白制品致敏性的方法，包括挤压膨化加工、微生物发酵、酶解处理等，并取得了一些进展。高效、灵敏、快捷的致敏原检测技术，是大豆及其制品利用技术开发取得成功的重要保障。目前，大豆蛋白致敏原检测常用方法有高效液相色谱(HPLC)、聚合酶链式反应 (PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。HPLC具有分离效率高、分析速度快、检测限低等优点，被认为是迄今为止对复杂混合物分离效能最高的一种分离分析技术，但它并不能区分被检物的免疫活性(致敏性)。PCR被广泛用于大豆、榛子、花生等食品中微量抗原成分的检测，具有敏感性和特异性高等特点。但该技术是建立在特异DNA片段PCR扩增基础上，特异性DNA的检出，并不能直接反应出样品中含有具免疫活性的致敏原的情况，从而限制了该方法在致敏原检测中的应用。致敏原的免疫原性是发生过敏反应的前提条件。以抗原、抗体特异性反应为基础的ELISA是致敏原检测的最佳选择。ELISA能够快速、准确地对样品中致敏原进行定性定量检测，并且不需要昂贵的设备和复杂的操作步骤，被广泛应用在食品和饲料行业。ELISA的关键是合适抗体的研发。彭楠等(2007)制备了大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白多克隆抗体，并在此基础上建立了间接竞争ELISA方法(彭楠，刘建峰，梁运祥，葛向阳.间接竞争ELISA检测大豆IlS球蛋白和7S伴球蛋白.华中农业大学学报， 2007,26 (5) 661-664)。多克隆抗体是大豆蛋白中多个抗原表位同时刺激动物产生的针对不同抗原表位的抗体混合物，既可与大豆蛋白中无致敏性的抗原表位结合，又可能与大豆蛋白以外的其它蛋白上的抗原表位结合(即交叉反应)，因此以其为基础建立的大豆蛋白致敏原检测技术其结果并不完全可靠。游金明等(2008)采用人工合成伴大豆球蛋白上一段表位肽作为免疫抗原，制备了单克隆抗体，在此基础上建立了 ELISA检测方法(游金明，王自蕊，谯仕彦，贺平丽，李德发.致仔猪过敏性大豆抗原蛋白β-conglycinin 单克隆抗体的制备与鉴定.中国畜牧杂志，2008，44 (17): 46-48)。但由于该表位是选自 β-伴大豆球蛋白上的任意抗原表位，依然不能解决大豆蛋白中致敏性成分的特异性检测问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种针对伴大豆球蛋白α亚基 IgE过敏抗原表位的单克隆抗体制备方法。用本专利技术方法制备的单克隆抗体，能与伴大豆球蛋白各组成亚基中致敏性最强的α亚基中引起IgE过敏反应的抗原表位结合，表位明确、特异性强，明显优于现有技术制备的抗体，在大豆品种选育与改良、β -伴大豆球蛋白分离纯化与检测、β -伴大豆球蛋白致敏机理研究等领域具有广泛用途。本专利技术方法包括以下步骤步骤(1).制备抗原采用化学法或基因工程技术制备含β-伴大豆球蛋白α亚基IgE 抗原表位的表位小肽，然后将此表位小肽耦联到载体蛋白或载体多肽上，制备免疫用抗原； 所述的载体蛋白或载体多肽包括但不限于牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白。所述的表位小肽中氨基酸序列如下述SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 7的任意1条 ① NH2-repqqpgekeededeqprpC_CONH2 ；(2) NH2-EffPRKEEKRGEKGC-CONH2 ；③NH2-khnkcIqscnserdsyrn-CONH2 ；④NH2-IlefnskpnC-CONH2 ；⑤Nh2-IjQrfnqrspqlqnlrC-Conh2 ； nh2-selrrhknknpflfgc-conh2 ； ⑦ nh2-knpflfgsnrfetlfc-conh2 ；所述的表位小肽氨基酸序列，在不改变表位小肽抗原表位结构的前提下，小肽一端或两端增加有氨基酸。步骤O).免疫动物将耦联载体的表位小肽与弗氏佐剂混合免疫动物，第一次用完全弗氏佐剂，以后用不完全弗氏佐剂，每两周免疫一次，并于融合前2 4天等量抗原加强免疫。其中，供免疫动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔。步骤(3).细胞融合、筛选及克隆化选取抗血清效价最高的动物取脾细胞与骨髓瘤细胞体外融合，经三次亚克隆获得稳定分泌抗β-伴大豆球蛋白单克隆抗体的细胞株。步骤细胞培养将上述细胞株体外扩大培养后，收集上清液。步骤(5).腹水制备将扩大培养后的杂交瘤细胞株注入动物腹腔，以大量生产腹水，提取、纯化后即可得到伴大豆球蛋白单克隆抗体。本专利技术与目前常用的多克隆抗体或单克隆抗体相比，具有以下技术效果(1)与多克隆抗体相比，本专利技术制备的单克隆抗体特异性强，与其它蛋白无交叉反应，且来源可靠，质量稳定均一；(2)与常规单克隆抗体相比，本专利技术制备的单克隆抗体能与β-伴大豆球蛋白各组成亚基中致敏性最强的α亚基的IgE过敏抗原表位结合，表位明确、特异性强， 该单克隆抗体使用时反映的是真正具有致敏活性的伴大豆球蛋白；而常规单克隆抗体所针对的是抗原蛋白中的任意表位，使用此类单克隆抗体时并不能准确获取有关具致敏活性的β -伴大豆球蛋白信息，从而使其应用价值受到影响，应用范围受到限制。具体实施例方式1 材料雌性Balb/c小鼠购自苏州爱尔麦特生物科技有限公司，弗氏完全佐剂、HAT、HT、鲁米诺、香豆酸、Na2-EDTA、TMB均购自sigma，IMDM培养基和青链霉素购自hyclone，DMSO 购自biomol，PEG购自roche，胎牛血清购自上海依科赛公司，HRP标记二抗购自苏州百奇公司，浓硫酸和丙三醇购自上海试一化学试剂公司，柠檬酸购自国药化试公司，H2A 购自上海三鹰化学试剂公司。含伴大豆球蛋白α亚基IgE抗原表位的表位小肽 “NH2-KNPFLFGSNRFETLFC-C0NH2，，及与载体耦联的免疫抗原委托苏州百奇生物公司制备。2 方法2.1免疫动物将免疫抗原与弗氏完全佐剂混合乳化后注射到小鼠腹腔，分别在初次免疫后第2、4、6、8周将抗原与弗氏不完全佐剂混合后进行加强免疫。取小鼠脾脏前36-48 小时用等量免疫抗原不加佐剂，加强免疫一次。2.2细胞融合、筛选及克隆化于融合前36本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐子伟，李永明，刘海军，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：