牛iPS细胞拟胚体的制作方法技术

本发明专利技术公开了牛iPS细胞拟胚体的制作方法，包括牛胎儿成纤维细胞的培养、牛iPS细胞的诱导和培养及鉴定、牛iPS细胞的拟胚体制作、牛iPS细胞的拟胚体悬浮培养和牛iPS细胞的拟胚体体外分化能力检测。该制作方法形成的牛iPS细胞拟胚体避免了传统拟胚体的悬滴操作、拟胚体组成细胞纯度高、拟胚体组成细胞体外分化能力强等特点，结果显示了牛iPS细胞拟胚体的制作方法具有实用性强、易操作和推广等优点。

【技术实现步骤摘要】
牛i PS细胞拟胚体的制作方法本专利技术涉及动物细胞的拟胚体制作方法，尤其涉及一种。胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ES细胞)是一种来源于囊胚内细胞团的多能性干细胞群体，具有较强的再生能力和可塑性，在体外培养环境条件下，能够高效地进行外源基因导入、基因敲除或基因改造等遗传修饰操作。在一定的诱导环境条件下ES细胞能够分化形成机体所有类型的组成细胞，包括雌性的卵母细胞和雄性的精子。ES细胞向卵母细胞和精子的分化将会为转基因动物的生产、新品种培育、野生动物保护及人的生殖健康等奠定重要的基础，具有极强的应用价值和现实意义。iPS细胞(Induced pluripotent stem cell)作为一种新型的多能性干细胞，与ES 细胞在细胞形态、增殖、基因表达和畸胎瘤形成、分化能力等方面具有相似或相同的特性。 2006年日本科学家Yamanaka实验室率先利用逆转录病毒介导0ct4、Klf4、Sox2和c_Myc 四个基因在小鼠成纤维细胞表达后，成纤维细胞转变成这种与小鼠ES细胞性能相似或相同的多能性干细胞被称为iPS细胞。高产优质牛的胚胎来源稀少，牛ES细胞分离培养成功率极本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种牛ｉＰＳ细胞拟胚体的制作方法，包括如下步骤：（１）细胞培养和慢病毒感染取妊娠约２．５和４月龄牛胎儿，采用组织块培养法添加高糖ＤＭＥＭ培养液分别建立牛胎儿成纤维细胞系；磷酸钙介导四种限定基因融合蛋白Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４慢病毒表达载体及其包装组分在２９３Ｔ细胞中构建成限定因子慢病毒，１２－１６ｈ后更换新鲜培养液，病毒包装４８ｈ后收集病毒液，经超滤浓缩后添加到牛胎儿成纤维细胞培养板内，细胞密度为１．０４×１０４／ｃｍ２，添加含终浓度为１０μｇ／ｍｌ　Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ高糖ＤＭＥＭ培养液，第１次病毒感染后第２ｄ更换含１０００Ｕ／ｍｌＬＩＦ、４ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ的高糖ＤＭＥ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹鸿国，章孝荣，蒲勇，杨盼，张运海，刘亚，陶勇，方富贵，李运生，任春环，张子军，刘洪瑜，丁建平，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：34