具有鳞翅目活性的新的苏云金芽孢杆菌基因制造技术

本发明专利技术提供获自苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株的核酸，及其变体和其片段，其编码具有针对包括鳞翅目的虫害的杀虫活性多肽。本发明专利技术的特定实施方式提供编码杀虫蛋白的分离的核酸、杀虫组合物、ＤＮＡ构建体，和包含实施方式的核酸的转化的微生物和植物。所述组合物用于控制害虫尤其是植物害虫的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及从新的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)基因获得的天然存在的核酸和重组核酸，所述基因编码以抗虫害杀虫活性为特征的杀虫多肽。本专利技术的组合物和方法使用所公开核酸及其所编码的杀虫多肽来控制植物疫害。
技术介绍
虫害是世界农作物损失的主要因素。例如，粘虫进食、 黑切根虫损害或欧洲玉米螟损害可以在经济上摧毁农业生产者。仅欧洲玉米螟攻击田地和甜玉米带来的虫害相关的农作物损失就已在损害和控制开销上达到每年十亿美元。传统地，影响虫害群体的主要方法是应用广谱化学杀昆虫剂。然而，消费者与政府调节员一样越来越关心与生产和使用合成的化学杀虫剂相关的环境危害。调节员出于这种关心已禁止或限制使用一些更为危险的杀虫剂。因此，开发替代杀虫剂具有实质性利益。使用诸如真菌、细菌或其它昆虫物种的微生物剂对农业上重要的虫害进行生物学控制，这为合成的化学杀虫剂提供了对环境友好且具有商业吸引力的替代途径。一般来讲， 使用生物杀虫剂造成污染和环境危害的风险较低，并且生物杀虫剂相对于传统广谱化学杀昆虫剂的性质提供了更强的靶标特异性。此外，生物杀虫剂的生产成本通常更低，并因而提高大量品种的农作物的经济收益。已知芽孢杆菌属的某些种的微生物具有抗广谱虫害的杀虫活性，所述虫害包括鳞翅目(L印idoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)及其它。苏云金芽孢杆菌(Bt)和甲虫芽孢杆菌(Bacillus papilliae)属于迄今所发现的最为成功的生物控制剂。昆虫致病性还归因于幼虫芽孢杆菌(B. larvae)、缓病芽孢杆菌 (B. Ientimorbus)、球形芽孢杆菌(B. sphaericus) (Harwook, ed. , ((1989) Bacillus (芽孢杆菌)(Plenum Press) ,306)和赌状芽孢杆菌(B. cereus) (W0 96/10083)菌株。虽然也已从营养生长期的芽孢杆菌分离出杀虫蛋白，但是杀虫活性看上去集中在伴孢晶体蛋白包涵体上。已分离并表征编码这些杀虫蛋白的数种基因(参见，例如，美国专利第5，366，892号和第 5，840，868 号)。微生物杀昆虫剂，特别是获自芽孢杆菌菌株的那些，作为化学疫害控制的替代品在农业上起重要作用。近来，农业科研工作者通过基因工程改造农作物植物来产生来自芽孢杆菌的杀虫蛋白，已开发出具有增强的昆虫抗性的农作物植物。例如，玉米和棉花植物已被基因工程化以产生分离自Bt菌株的杀虫蛋白(参见，例如，Aronson (2002) CellMol. Life Sci.59(3) 417-425 ；Schnepf et al. (1998)Microbiol Mol Biol Rev. 62(3) :775_806)。 这些基因工程农作物现在广泛用于美国农业，并且向农民提供了传统昆虫控制方法的环境友好替代品。此外，已向美国农民销售经基因工程改造而包含杀虫的Cry毒素的马铃薯。这些基因工程改造的抗昆虫的农作物植物已被证明在商业上非常成功，但是它们仅提供对小范围的商业上重要虫害的抗性。因此，仍需要具有更广泛的抗虫害杀昆虫活性的新的Bt毒素，例如对鳞翅目中更多品种的昆虫具有活性的毒素。此外，仍需要具有抗更多虫害活性的生物杀虫剂和具有改良杀昆虫活性的生物杀虫剂。专利技术概述本专利技术提供影响虫害的组合物和方法。更具体地，本专利技术的实施方式涉及影响昆虫的方法，所述方法利用编码杀昆虫肽的核苷酸序列，从而产生表达实施方式中的杀昆虫多肽的转化的微生物和植物。这些害虫包括农业上重要的害虫，诸如，例如，欧洲玉米螟 (欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis Hubner))和棉铃虫(谷实夜蛾(Heliothis zea))。在一些实施方式中，该核苷酸序列编码对属于鳞翅目的至少一种昆虫具有杀虫性的多肽。实施方式提供核酸及其片段和其变体，其编码具有抗虫害杀虫活性的多肽(例如，编码SEQ ID NO :2的SEQ ID NO :1)。实施方式的野生型(例如，天然存在的)核苷酸序列编码新的杀昆虫肽，所述核苷酸序列获得自Bt。实施方式还提供所公开的编码生物学活性(例如，杀昆虫)多肽的核苷酸序列的片段及变体。实施方式还提供分离的杀虫(例如，杀昆虫)多肽，其由实施方式的天然存在的核酸或经修饰的(例如，突变的或经操作的)核酸所编码。在特定实例中，实施方式的杀虫蛋白包括全长蛋白和多肽的片段，其产生自突变的核酸，所述核酸经设计以将特定氨基酸序列引入实施方式的多肽。在特定实施方式中，所述多肽相对于其衍生自的天然存在的多肽具有增强的杀虫活性。实施方式的核酸还可以用于产生转基因的(例如，转化的)单子叶或双子叶植物， 所述植物的特征在于基因组包含至少一个稳定整合的核苷酸构建体，所述构建体包含实施方式的编码序列，所述编码序列与驱动所编码杀虫多肽表达的启动子可操作地连接。因此， 还提供转化的植物细胞、植物组织、植物及其种子。在特定实施方式中，可以使用经优化而在宿主植物中提高表达的核酸来产生转化的植物。例如，可以回译(backtranslate)实施方式的一种杀虫多肽，从而产生包含为在特定宿主中表达而优化的密码子的核酸，所述特定宿主例如诸如玉米(Zea mays)植物的农作物植物。这种转化的植物(例如，双子叶或单子叶植物)表达编码序列，从而导致产生杀虫多肽，并赋予所述植物增加的昆虫抗性。一些实施方式提供表达杀虫多肽的转基因植物，所述杀虫多肽用于影响各种虫害的方法。实施方式还包括含有实施方式的杀昆虫多肽的杀虫或杀昆虫组合物，并且可以任选地包括另外的杀昆虫肽。实施方式包括将该组合物应用于虫害环境，从而影响虫害。专利技术详述本专利技术的实施方式涉及影响虫害、特别是植物疫害的组合物和方法。更为具体地， 实施方式的分离的核酸及其片段和其变体包含编码杀虫多肽(例如蛋白)的核苷酸序列。 所公开的杀虫蛋白对诸如但不限于鳞翅目虫害的虫害具有生物学活性(例如杀虫性)。目的虫害包括但不限于欧洲玉米螟(欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis))和棉铃虫(谷实夜蛾(Heliothis zea))。实施方式的组合物包含分离的核酸及其片段和其变体，其编码杀虫多肽、包含实施方式的核苷酸序列的表达盒、分离的杀虫蛋白和杀虫组合物。一些实施方式提供经修饰的杀虫多肽，所述多肽的特征在于相对于相应野生型蛋白的杀虫活性具有改良的抗鳞翅目杀昆虫活性。实施方式还提供用这些新的核酸转化的植物和微生物，以及涉及将该核酸、杀虫组合物、转化生物体及其产物用于影响虫害的方法。实施方式的核酸和核苷酸序列可以用于转化任何生物体，从而产生所编码的杀虫蛋白。所提供的方法涉及将该转化生物体用于影响或控制植物疫害。实施方式的核酸和核苷酸序列还可以用于转化诸如叶绿体的细胞器(McBride et al. (1995) Biotechnology 13 :362-365 ；和 Kota et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :1840-1845)。实施方式还涉及鉴定编码生物学活性杀虫蛋白的天然存在的编码序列片段和变体。实施方式的核苷酸序列直接用于影响疫害、特本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．分离的核酸分子，选自：（ａ）包含ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１核苷酸序列的核酸分子或其全长互补序列；（ｂ）编码包含ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２氨基酸序列的多肽的核酸分子；（ｃ）编码包含氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列特征在于与（ｂ）的氨基酸序列具有至少９０％序列一致性；和（ｄ）编码包含氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列特征在于与（ｂ）的氨基酸序列具有至少９５％序列一致性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德烈·R·阿贝德，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：US