一种海洋青霉Swollenin基因及其编码的蛋白质与应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程研究领域，提供了一种海洋青霉Swollenin基因、其编码的蛋白质，及其在提高纤维素酶活性方面的应用。海洋青霉Swollenin基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，其编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。本发明专利技术所述海洋青霉Poswollenin能有效提高纤维素酶活性，促进结晶纤维素的水解效率，这样能减少纤维素酶的用量，节省生产成本，促进纤维素乙醇的工业化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程研究领域，具体海洋青霉Swollenin基因、其编码的蛋白质， 及其在提高纤维素酶活性方面的应用。
技术介绍
木质纤维素是地球上含量最丰富的可再生资源，主要由纤维素、半纤维素和木质素等成分构成。木质纤维素可经预处理和纤维素酶水解转变为葡萄糖等单糖，后者可经微生物发酵生产纤维素乙醇，这一途径的开发和工业化对缓解当前日益严重的能源危机和温室效应具有重要意义。然而，木质纤维素中的纤维素组分因氢键而形成结晶结构(纤维素微纤丝)，而且纤维素微纤丝又和半纤维素、木质素等通过氢键形成牢固的复杂网络结构， 使得木质纤维素难以被纤维素酶水解。纤维素酶对纤维素的水解效率低下是纤维素乙醇工业化生产的主要瓶颈之一。植物扩张蛋白是从植物细胞壁中分离的一类蛋白，它没有水解酶活性，但可以破坏纤维素微纤丝之间或微纤丝和其它细胞壁多糖之间的氢键，具有松弛细胞壁结构和促进细胞生长的功能。Swollenin是丝状真菌中与植物扩张蛋白同源的一类蛋白，它也具有植物扩张蛋白类似的破坏植物细胞壁的功能。纤维素难以被纤维素酶降解的主要原因是因氢键而形成的牢固结构，因此，能破坏氢键的扩张蛋白和Swollenin有可能成为促进纤维素酶水解活性的辅助因子。植物扩张蛋白由于难以实现有效的异源重组表达而限制了它在这方面的应用。2002年，Swollenin首次在产纤维素酶真菌里氏木霉中被鉴定出来 (Saloheimo M, Paloheimo M.Eur J Biochem. 2002，269 :4202-4211)。该蛋白能破坏棉花的纤维结构，使滤纸软化，并能破坏斛果壳的细胞壁。里氏木霉Swollenin虽能实现在酵母和黑曲霉的异源重组表达，但表达量较低；且该研究的作者未进行任何关于Swollenin促进纤维素酶活性的研究。2006年，Levasseur将里氏木霉Swollenin与黑曲霉的阿魏酸酯酶 Feruloyl esterase A进行融合表达，发现该融合蛋白处理麦麸后能使阿魏酸的释放率提高 50%，提示 SwolIenin 能促进水解酶的活性(Levasseur A, Saloheimo Μ. Appl Microbiol Biotechnol. 2006，73 :872-880)。2010 年，Wang 成功用米曲霉表达的重组 Swollenin 使纤维素酶活性提高 81% (Wang Μ, Cai J. Appl Biochem Biotechnol. 2010，162 :2027-2036)。 从已有结果看，Swollenin的研究尚存在如下一些问题(I)Swollenin促进纤维素酶水解纤维素的活性较弱；(2)Sw0llenin与纤维素酶协同作用的处理工艺较单一；(3)目前研究的Swollenin主要来源于陆生真菌，对海洋真菌Swollenin的研究未见报道。海洋因其高压、低温、无光照、高盐等生命极限环境，使得海洋真菌有可能合成更特别的蛋白并使之具有更高的活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种海洋青霉Swollenin基因，其核苷酸序列如SEQID No 1所示。本专利技术的第二个目的在于提供一种海洋青霉Swollenin基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本专利技术的第三个目的在于提供一种含有海洋青霉Swollenin基因的表达载体。本专利技术的第四个目的在于提供一种含有海洋青霉Swollenin基因表达载体的转化细胞。本专利技术的第五个目的在于提供所述海洋青霉Swollenin基因在提高纤维素酶活性上的应用。本专利技术的第六个目的在于提供用所述海洋青霉Swollenin基因所编码的蛋白质在提高纤维素酶活性上的应用。本专利技术的第七个目的在于提供述海洋青霉Swollenin基因在纺织工业中的应用。本专利技术的第八个目的在于提供用所述海洋青霉Swollenin基因所编码的蛋白质在纺织工业中的应用。本专利技术的第九个目的在于提供所述海洋青霉Swollenin基因在纤维素乙醇工业中的应用。本专利技术的第十个目的在于提供用所述海洋青霉Swollenin基因所编码的蛋白质在纤维素乙醇工业中的应用。本专利技术通过以下技术方案实现1)克隆Swollenin基因提取海洋青霉Penicillium oxalicum基因组DNA，设计引物，通过PCR技术从海洋青霉Penicillium oxalicum基因组DNA中克隆Swollenin基因， 命名为 poswollenin。2)构建重组蛋白诱导型表达载体利用里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh 1的启动子、信号肽和终止子序列，以质粒PPICZ α A为出发载体，构建重组蛋白诱导型表达载体 pPIC-PTο3)海洋青霉poswollenin在里氏木霉的诱导型表达将poswollenin基因插入表达载体PPIC-PT的Sfi I和Not I位点之间，构建成重组质粒pPIC-poswollenin。将重组质粒pPIC-poswollenin转化里氏木霉RUT-C30原生质体，然后将得到的poswollenin木霉转化子接种诱导产酶培养基，在微晶纤维素的诱导下进行Poswollenin的合成和分泌表达。4)Poswollenin重组蛋白的分离纯化=Poswollenin重组蛋白采用如下技术流程进行分离纯化培养上清离心——超滤浓缩——硫酸铵沉淀——亲和层析——脱盐。5)Poswollenin促进纤维素酶水解效率验证a)将不同浓度的Poswollenin与不同浓度的纤维素酶进行同步反应、分步反应， 0-48h范围内不同时间取样测定反应产生的还原糖，摸索促进纤维素酶活性的最佳条件；b)将Poswollenin与纤维素材料(滤纸、微晶纤维素等)混合作用，用显微镜观察纤维素材料的结构变化，分析Poswollenin破坏结晶纤维素的机理，为进一步优化 Poswollenin与纤维素酶协同作用的条件指明方向。本申请所述海洋青霉Poswollenin能有效提高纤维素酶活性，促进结晶纤维素的水解效率，这样能减少纤维素酶的用量，节省生产成本，促进纤维素乙醇的工业化。另外本申请构建的蛋白表达载体pPIC-PT，能有效提高重组蛋白的产量，使得目的说明书3/5页CN 102309466 A富马酸喹硫平230. 26g预胶化淀粉32. 32g微晶纤维素43.42g柠檬酸钠ニ水化合物75g羟丙甲纤维素E508g50%乙醇66g聚氧乙烯N-12140g聚氧乙烯N-6035g硬脂酸镁7g硬脂酸5gニ氧化硅4g合计580g按下述エ艺制备(1)将230. 26g富马酸喹硫平、32. 32g预胶化淀粉、43. 42g微晶纤维素、8g羟丙甲 纤维素和75g柠檬酸钠ニ水化合物分别按要求粉碎过筛，混合均勻，用50%乙醇制成适宜 的软材，制粒；(2)将湿颗粒干燥，整粒，整粒时加入140g聚氧乙烯N_12、35g聚氧乙烯N_60、7g 硬脂酸镁、5g硬脂酸、4g滑石粉辅料混合均勻。(3)压片。(4)包衣。实施例2 每1000片富马酸喹硫平缓释片(200mg)含富马酸喹硫平230. 26g预胶化淀粉34. 32g微晶纤维素PH 10134. 32g柠檬酸钠ニ水化合物75g羟丙甲纤维素E508g50%乙醇66g聚氧乙烯1105124. Ig聚氧本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种海洋青霉Ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ基因，其核苷酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１所示。

【技术特征摘要】
1.一种海洋青霉Swollenin基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:l所示。2.权利要求1所述的海洋青霉Swollenin基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2 所示。3.含有权利要求1所述海洋青霉Swollenin基因的表达载体。4.含有权利要求3所述表达载体的转化细胞。5.权利要求1所述海洋青霉Swollenin基因在提高纤维素酶活性上的应用。6.权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢苗，刘刚，康康，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：94