肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法，它涉及nifH基因的克隆与表达方法。方法：提取肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA；PCR扩增获得目的基因nifH，与载体连接，获得重组质粒pMD18-T-nifH；提取质粒，双酶切后构建重组质粒PET28a-nifH，再转化大肠杆菌，获得含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌；然后接种到含卡那霉素的LB液体培养基中培养，获得培养菌液；然后加入到含卡那霉素的LB液体培养基中培养，然后加IPTG培养，进行诱导表达；通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现即完成。本发明专利技术对开发人畜无毒、环保的杀白蚁生物药剂具有重要的理论意义和现实意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及nifH基因的克隆与表达方法。
技术介绍
白蚁Termite属于节肢动物门昆虫纲有翅亚纲等翅目的昆虫，是较为古老的社会性害虫。每年因白蚁危害建筑物和农作物所造成的经济损失达千亿美元以上。现有的杀灭白蚁的药剂均为化学药剂，故都有很大的毒副作用，造成严重的环境污染。利用生物技术开发具有高效、无毒、残效期长、对环境影响小的白蚁生物防治剂成为未来白蚁防治剂的主要方向。Termite属于典型的寡氮营养型生物，其肠道固氮微生物的固氮作用是白蚁体内氮素的主要来源。目前，科学家已从白蚁科、鼻白蚁科、木白蚁科、原白蚁科的部分属中克隆得到了大量nifH基因序列。系统发育分析表明，同一属的白蚁肠道共生固氮菌nifH基因具有更近的亲缘关系，不同白蚁肠道共生固氮菌nifH基因多样性明显不同。虽然已知白蚁肠道nifH基因具有较高多样性，但仅有少量的nifH基因能够被优先转录并表达出来，大多数的nifH基因不能被表达。因此，在白蚁肠道内克隆和表达nifH基因，对于了解白蚁的固氮机制和白蚁的生物防治提供新的途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。按以下步骤进行一、取3mL肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004的菌液，以12000r/min离心lmin，弃去上清，然后按照TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒的操作方法提取基因组DNA ；二、以步骤一中提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因nifH，然后与pMD18-T载体连接，获得重组质粒pMD18-T-nifH ；三、按照TIANGEN质粒小提试剂盒的操作方法提取重组质粒pMD18-T-nifH和 pET28a质粒，然后用EcoR I和Nde I分别对重组质粒pMD18-T_nifH和pET28a质粒进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒PET28a-nifH，再转化大肠杆菌BL21，获得含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌；四、将含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中， 在37°C、150r/min的条件下培养16h，获得培养菌液；五、取200 μ L培养菌液加入到20mL含卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C、 150r/min的条件下培养3h，然后加IPTG (异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度为 0. 5mmol/L,在20°C、150r/min的条件下培养2h、3h、4h、5h、过夜，进行诱导表达；六、诱导表达后的菌液通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现，即完成肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达；其中步骤一中肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004，它为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)HUB-IV-004，属于克雷伯菌属(Klebsiella)，它的保藏编号为 CCTCC NO =M 2011312，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为 2011年9月15日；步骤二中PCR扩增所用引物pi的核苷酸序列为5' -GAATTCTCAGGCCGC GTTTTCTTCAG-3 ‘，引物 p2 的核苷酸序列为5‘ -CATATGATGACCATGCGTCAATGCG-3 ‘；步骤二中目的基因nifH的核苷酸序列如SEQID No. 3所示；步骤四和五中含卡那霉素的LB液体培养基为相同的培养基，每IOOOmL由50μ g的卡那霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、 IOgNaCl的和余量的水组成。本专利技术利用从白蚁肠道内分离出的肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004研究基因nifH的克隆与表达，了解了白蚁的固氮机制，开发了可利用的固氮微生物资源及筛选，对开发人畜无毒、环保的杀白蚁生物药剂具有重要的理论意义和现实意义。附图说明图1为本专利技术中nifH基因PCR扩增产物电泳图，其中M泳道:DNA Marker DL2000, 1泳道HUB-IV-004nifH扩增片段；图2为本专利技术中nifH基因在BL21中表达产物的SDS-PAGE分析的电泳图，其中M 泳道蛋白质分子质量标准；1-6泳道IPTG诱导0h，lh，2h，3h，4h，16h的表达产物。具体实施例方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式按以下步骤进行一、取3mL肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004的菌液，以12000r/min离心lmin，弃去上清，然后按照TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒的操作方法提取基因组DNA ；二、以步骤一中提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因nifH，然后与pMD18-T载体连接，获得重组质粒pMD18-T-nifH ；三、按照TIANGEN质粒小提试剂盒的操作方法提取重组质粒pMD18-T-nifH和 pET28a质粒，然后用EcoR I和Nde I分别对重组质粒pMD18-T_nifH和pET28a质粒进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒PET28a-nifH，再转化大肠杆菌BL21，获得含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌；四、将含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中， 在37°C、150r/min的条件下培养16h，获得培养菌液；五、取200 μ L培养菌液加入到20mL含卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C、 150r/min的条件下培养3h，然后加IPTG至终浓度为0. 5mmol/L，在20°C、150r/min的条件下培养2h、3h、4h、5h、过夜，进行诱导表达；六、诱导表达后的菌液通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现，即完成肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达；其中步骤一中肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004，它为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-004，属于克雷伯菌属(Klebsiella)，它的保藏编号为 CCTCC NO =M2011312，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为 2011年9月15日；步骤二中PCR扩增所用引物pi的核苷酸序列为5' -GAATTCTCAGGCCGC GTTTTCTTCAG-3 ‘，引物 p2 的核苷酸序列为5‘ -CATATGATGACCATGCGTCAATGCG-3 ‘；步骤二中目的基因nifH的核苷酸序列如SEQID No. 3所示；步骤四和五中含卡那霉素的LB液体培养基为相同的培养基，每IOOOmL由50μ g的卡那霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、 IOgNaCl的和余量的水组成。本实施方式步骤二中获得目的基因nifH 经琼脂糖凝胶电泳检验特异条带的大小，大小为882bp，条带清晰、完整，无DNA、RNA等污染，且此片段大小与预计的片段条带大小基本吻合(见图1)，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，其氨基酸序列如SEQ IDNo. 4 所示。本实施方式步骤六中诱导表达后的菌液通过SDS-PAGE分析过程为①、分别吸取诱导表达2h、3h、4h、5h、过夜的菌液10mL，4°C，12000r/min离心5min收集菌体，加入5mL本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．肺炎克雷伯氏菌ｎｉｆＨ基因的克隆与表达方法，其特征在于肺炎克雷伯氏菌ｎｉｆＨ基因的克隆与表达方法按以下步骤进行：一、取３ｍＬ肺炎克雷伯氏菌ＨＵＢ－ＩＶ－００４的菌液，以１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，弃去上清，然后按照ＴＩＡＮＧＥＮ公司的细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒的操作方法提取基因组ＤＮＡ；二、以步骤一中提取的基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，获得目的基因ｎｉｆＨ，然后与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接，获得重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ－ｎｉｆＨ；三、按照ＴＩＡＮＧＥＮ质粒小提试剂盒的操作方法提取重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ－ｎｉｆＨ和ｐＥＴ２８ａ质粒，然后用ＥｃｏＲ Ｉ和Ｎｄｅ Ｉ分别对重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ－ｎｉｆＨ和ｐＥＴ２８ａ质粒进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒ＰＥＴ２８ａ－ｎｉｆＨ，再转化大肠杆菌ＢＬ２１，获得含有质粒ＰＥＴ２８ａ－ｎｉｆＨ的大肠杆菌；四、将含有质粒ＰＥＴ２８ａ－ｎｉｆＨ的大肠杆菌接种到含卡那霉素的ＬＢ液体培养基中，在３７℃、１５０ｒ／ｍｉｎ的条件下培养１６ｈ，获得培养菌液；五、取２００μＬ培养菌液加入到２０ｍＬ含卡那霉素的ＬＢ液体培养基中，在３７℃、１５０ｒ／ｍｉｎ的条件下培养３ｈ，然后加ＩＰＴＧ至终浓度为０．５ｍｍｏｌ／Ｌ，在２０℃、１５０ｒ／ｍｉｎ的条件下培养２ｈ、３ｈ、４ｈ、５ｈ、过夜，进行诱导表达；六、诱导表达后的菌液通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，发现有特异性条带出现，即完成肺炎克雷伯氏菌ｎｉｆＨ基因的克隆与表达；其中步骤一中肺炎克雷伯氏菌ＨＵＢ－ＩＶ－００４，它为肺炎克雷伯氏菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＨＵＢ－ＩＶ－００４，属于克雷伯菌属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ），它的保藏编号为ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０１１３１２，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为２０１１年９月１５日；步骤二中ＰＣＲ扩增所用引物ｐ１的核苷酸序列为：５′－ＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧ－３′，引物ｐ２的核胰蛋白胨、５ｇ的酵母浸粉、１０ｇＮａＣｌ的和余量的水组成。苷酸序列为：５′－ＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡＴＧＣＧＴＣＡＡＴＧＣＧ－３′；步骤二中目的基因ｎｉｆＨ的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３所示；步骤四和五中含卡那霉素的ＬＢ液体培养基为相同的培养基，每１０００ｍＬ由５０μｇ的卡那霉素、１０ｇ的...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵凯，张小燕，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：93
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。