在变性条件下蛋白纯化的方法技术

本发明专利技术涉及制备用于在变性条件下通过固定化金属亲和色谱（ＩＭＡＣ）纯化蛋白的应用缓冲液的方法，其特征在于，将具有预定ｐＨ值的预定量的缓冲液浓缩物与预定量的尿素浓缩物混合，由此提供具有预定ｐＨ值的应用缓冲液。根据本发明专利技术还提供相应的试剂盒。其组分是贮存稳定的且通过混合产生具有预定ｐＨ值的预定组成的应用缓冲液。本发明专利技术由此是能自动化和作为封闭试剂盒理念能使用的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及蛋白纯化的方法以及为此合适的试剂盒和缓冲液体系。为了在变性条件下通过固定化金属亲和色谱(以下IMAC)纯化蛋白，通常或者使 用含盐酸胍的缓冲液(参见Hochuli等人，1988)，或者使用高度浓缩的含尿素的缓冲液。相 对于含盐酸胍的缓冲液，含尿素的缓冲液提供以下优点用含尿素的缓冲液纯化的蛋白可 以直接在SDS凝胶上分析。蛋白与基质的最佳结合、洗涤步骤的严格性以及感兴趣蛋白的 有效洗脱决定性地取决于单个缓冲液的PH值。然而，本领域已知的含尿素的缓冲液随时间失去其缓冲作用，特别是因为其pH值 升高。由此降低洗涤步骤的严格性以及由此的蛋白纯化的选择性。由于较高的PH值，蛋白 非特异性地结合到基质上，并且不再能有效地洗出。洗脱效率也下降。为了在变性条件下 通过IMAC纯化His标记的重组蛋白，由此在每次应用前必须新鲜配制所使用的含尿素的缓 冲液或必须校正其PH值，S卩，重新调节。这是费时的且相应地是不利的。由此出发本专利技术的目的在于，提供蛋白纯化的改进方法。通过在权利要求1-16中所述的方法、试剂盒和缓冲液体系获得上述问题的解决方案。根据本专利技术的一个具体实施方式，提供用于在变性条件下通过IMAC纯化蛋白的 应用缓冲液的方法，该方法的特征在于，将具有预定PH值的预定量的缓冲液浓缩物与预定 量的变性浓缩物，优选尿素浓缩物混合，由此提供具有预定PH值的应用缓冲液。在本专利技术的上下文中，使用术语“缓冲液浓缩物”和“应用缓冲液”。术语“缓冲液 浓缩物”是指不直接用于纯化而是先与尿素混合的缓冲液，以获得实际的应用缓冲液。缓冲 液浓缩物优选不具有尿素。首先，尿素不以干扰的量存在。术语“应用缓冲液”用于已与尿 素混合并可以直接用于蛋白纯化的缓冲液，例如作为结合缓冲液、洗涤缓冲液或洗脱缓冲 液。本专利技术的核心是分开提供用于蛋白纯化所必需的、彼此相互反应并由此导致pH 值升高的组分。根据本专利技术，提供至少一种与尿素浓缩物分开的、具有预定的且相应预调 PH值的缓冲液浓缩物。预定量的尿素浓缩物只在应用前才与预定量的缓冲液浓缩物混合， 由此获得具有预定组成和预定且相应的所期望PH值的应用缓冲液。分开提供浓缩物的优 点在于，单个组分(缓冲液浓缩物和尿素浓缩物)是贮存稳定的并且分开贮存的浓缩物的 PH值在长时间保持恒定(图3中也可见)。通过仅混合2种组分，即缓冲液浓缩物和尿素 浓缩物，在浓缩物长时间贮存后能够自行产生具有预定组成和预定PH值的应用缓冲液(见 图4)。在本专利技术方法中，与现有技术不同之处在于，在蛋白纯化之前或期间，重新调节pH值 由此是不必要的。也不必完全新配制应用缓冲液。在混合浓缩物之后可直接使用应用缓冲 液。对于用户而言，相应于“即刻可用”反应剂的使用特别是以试剂盒的形式是易于操作和 时间节省的。因为根据本专利技术总是产生相同组成且具有预定(相同)PH值的应用缓冲液， 因此纯化结果是可重复的且保持相同的质量。避免了应用缓冲液的受PH值限制的波动以 及与此相关的错误根源。根据本专利技术的方法不仅在手动方式上是用户友好的，此外而且是 可自动化的，因为仅需彼此相互混合组分，而无需精确调整或需要新配制应用缓冲液。用现有技术中已知的缓冲液体系和方法进行自动化是不太可能的。此外，由于缺乏PH稳定性， 能贮存的、封闭的试剂盒理念(在该理念下用户不用改变缓冲液)也是不可能的，因为用户 必须改变所提供的缓冲液(例如调节PH值)。根据本专利技术的方法，借助Ni2+-NTA(镍-次氮基三乙酸)_色谱特别有用于组氨酸 标记的蛋白纯化。根据本专利技术方法的具体实施方式，提供三种缓冲液浓缩物，其各自具有不同的、已 预调的PH值。缓冲液浓缩物的组成可以相同或不同。通过将该浓缩物与预定量的尿素混 合获得至少三种各自具有不同PH值的应用缓冲液。该方法的三个基本步骤，结合到基质、 洗涤基质和随后由基质洗脱感兴趣的蛋白分别需要具有特别合适的，即经调节的PH值的 缓冲液(见上文)。通过提供具有不同PH值的至少三种缓冲液浓缩物，通过与预定量的尿 素浓缩物混合制备至少三种应用缓冲液，该应用缓冲液不仅具有预定的组成，而且具有预 定的和针对各步骤合适的或必需的PH值。该应用缓冲液可直接使用，即无需由用户进一步 改变，或者可在自动方法中使用。根据本专利技术方法的具体实施方式，用于制备用于结合的应用缓冲液的缓冲液浓缩 物具有碱性PH值，优选在约7. 0-9. 0的PH值范围内，特别优选约7. 5的PH值。通过将该 缓冲液浓缩物与预定量的尿素浓缩物混合产生具有相同或更高PH值的应用缓冲液。根据 本专利技术的具体实施方式，用于结合的应用缓冲液具有碱性PH值，优选7. 0-9. 0的pH值，特 别优选约8的pH值。结合缓冲液也可以作为溶解缓冲液使用且反之亦然。根据该具体实施方式，用于制备洗涤基质的应用缓冲液的缓冲液浓缩物具有的弱 酸性PH值，优选5. 0-7. 0的pH值，特别优选约5. 6的pH值。通过将这些缓冲液浓缩物与 预定量的尿素浓缩物混合，产生具有较高PH值的应用缓冲液。根据具体实施方式，用于洗 涤基质和溶解非特异性结合的蛋白的应用缓冲液具有弱酸性至中性的PH值，优选5. 5-7. 0 的PH值，特别优选6-6. 5的pH值。根据具体实施方式，用于制备洗脱蛋白的应用缓冲液的缓冲液浓缩物具有酸性pH 值，优选小于4的pH值，特别优选小于3. 5的pH值。通过将这些缓冲液浓缩物与预定量的 尿素浓缩物混合，产生具有较高PH值的应用缓冲液。根据具体实施方式，用于从基质中洗 脱待纯化的蛋白的应用缓冲液具有酸性PH值，优选小于5. 5的pH值，特别优选小于5或在 约4.5的pH值。该缓冲液浓缩物的pH值在长时间保持稳定，如由图3中可见的那样。相对于现有 技术中已知的缓冲液，该PH稳定性的重要原因是在缓冲液浓缩物中不存在干扰量的尿素。 通过将确定量的缓冲液浓缩物与尿素浓缩物有针对性地混合，应用缓冲液实现预先可确定 的或预定的组成和预先可确定的或预定的PH值。通过该pH稳定性和组成恒定，蛋白纯化 方法的结果是可重复的且在质量上是类似的。因为用户不必自己配制缓冲液，避免了在组 成上的波动。由浓缩物产生的应用缓冲液的PH值在浓缩物长时间贮存下保持恒定，如由图 4中可见的那样。该缓冲液浓缩物优选含有生物缓冲液。生物缓冲液以多种形式被使用于生物学和 分子生物学领域。与经典的、无机缓冲的物质不同之处在于，它们不会不利地影响待检测的 体系。生物缓冲液通常含有兼性离子。对生物缓冲液的综述例如在SigmaAldrich的主页 (www. siRmaaldrich. com)上可以找到。根据本专利技术的具体实施方式，用于制备所述结合应用缓冲液的缓冲液浓缩物含有 在碱性中(优选在约7. 0-9.0的范围内)具有缓冲能力的缓冲液。HEPES(2-(2-羟乙 基)-1-哌嗪基)_乙磺酸)、MES (2-(N-吗啉代)乙磺酸)、磷酸钠缓冲液、柠檬酸缓冲液、 琥珀酸缓冲液或醋酸缓冲液在此作为可能的、根据本专利技术可使用的缓冲液被提及。优选使 用含胺的缓冲液。生物的、含胺缓冲液的优选实例是Tris缓冲液。根据本专利技术的具体实施方式，用于制备所述洗涤应用缓冲液和洗脱应用缓冲液的 缓冲液浓缩物含有在中性至酸性中(优选在约4. 0-7.本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备用于在变性条件下通过固定化金属亲和色谱（ＩＭＡＣ）纯化蛋白的应用缓冲液的方法，其特征在于，将具有预定ｐＨ值的预定量的缓冲液浓缩物与预定量的尿素浓缩物混合，由此提供具有预定ｐＨ值的应用缓冲液。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·德特斯克曼，
申请(专利权)人：快而精有限公司，
类型：发明
国别省市：DE