本发明专利技术总体上涉及荧光染料。本发明专利技术提供各种荧光染料和含有这些染料的试剂盒，其适用于标记各种生物分子、细胞和微生物。本发明专利技术还提供利用所述荧光染料进行研究和开发、法医鉴定、环境研究、疾病诊断、预后和／或治疗的各种方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含磺酰胺基团的咕吨染料交叉参考本申请要求2009年2月3日提交的美国临时申请系列号61/149，603的权益，该申请通过引用全文纳入本文。
技术介绍
荧光染料广泛用于生物学研究和医学诊断。荧光染料优于常规的放射性材料，因为荧光染料通常具有足够的检测灵敏度、廉价且低毒。具体地说，具有可区分颜色范围的各种荧光团使得能平行检测多种生物学靶标的多重试验更加实际。在体外和体内描述不同生物学靶标之间在空间和时间上的关系常要求能平行显现多个靶标。此外，产生大量荧光染料为进行高通量和自动化试验打开了新的通道，因而极大降低了每次试验的单位成本。此外，荧光染料的低毒性便于体外操控，还能更安全地进行生物学活性的体内成像。虽然荧光染料有各种优点，但常规染料有许多深远的局限性。例如，常规荧光染料通常易发生染料间淬灭，已知该现象能减弱染料的亮度。常将给定靶标偶联于多个染料分子以便最大程度提高标记靶标，例如生物分子，如蛋白质或DNA的亮度。对于许多常规荧光染料，标记靶标的荧光强度常不与所连接染料分子数成正比，由于，例如靶标所连多个染料之间的淬灭而弱于预计的强度。此类淬灭效应部分是因为所连染料分子之间的物理相互作用可能形成无荧光的染料二聚体。疏水相互作用可驱动二聚体形成。由于许多传统荧光染料，例如各种罗丹明染料和花青染料是高度疏水性芳族化合物，这些常用的染料尤其易在标记的生物分子上形成二聚体。将磺酸基团加入染料显示能减少二聚体形成。参见，例如美国专利号 5，268，486,6, 977，305,6, 130，101 和 Panchuk-Voloshina 等，J. Histochem. Cytochem. 47(9)，1179(1999)。然而，虽然磺化可减少二聚体形成，但也在生物分子中引入负电荷，因此可能增加破坏标记生物分子的生物学活性的风险。磺化染料(例如，AF488、AlexaFluor 532,Alexa Fluor 546和Alexa Fluor 568) 可用于抗体标记或标记其它大分子，其中多个染料分子通常很接近。在一些情况中，如果背景荧光信号的降低依赖于染料之间的相互作用，染料的电荷可影响标记生物分子的活性。 在一些情况中，标记的抗体可在某些细胞染色中产生高背景。为降低背景，可能需要利用带负电的聚合物以用作阻断剂(美国专利申请2008/0038772)。为最大程度提高荧光信号，需要在其最大吸收(波长)或附近激发荧光染料。现有激发光源的波长有限。例如，荧光显微镜、流式细胞术、PCR仪器、DNA测序仪器和其它荧光生物医学仪器通常利用488nm氩激光。许多常规染料光稳定性差，在强激光下发生快速光漂白，当要长时间追踪荧光信号时，已知该现象减弱染料的有效亮度。对于许多常规染料， 荧光还对pH改变敏感。在一些情况中，染料的磺化克服光稳定性低和pH敏感的缺点。磺化还增强水溶性和蓝移，即，染料的吸收波长向接近488nm氩离子激光线(argon ion laser line)的漂移。 然而，多个磺化基团造成染料相对不溶于非极性有机溶剂。在某些情况中，涉及相对非极性底物的标记反应优选非极性有机溶剂。专利技术概述因此，仍极其需要改进的组合物和方法从而能方便和有效地标记各种应用中的大量分子。本专利技术解决了此类需求并提供额外的优点。因此，本专利技术提供可能具有任何或所有以下特征的荧光化合物。在一方面，利用本专利技术荧光化合物制备的标记生物分子显示二聚体形成明显减少。在其它方面，本专利技术的化合物和标记生物分子显示其它所需特性，例如水溶性较高、荧光量子产量提高、光稳定性改善、合成相对简单、标记偶联物的特异性改善。在一些实施方式中，本文提供式I所示化合物权利要求1.式Ia或Λ所示化合物2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，X是0。3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，A是-NR1Rla,B是=N+R4R4a。4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，一对或多对的R2和I la、R3和R4a、R4和R5、 R5和和&、或&和R1与和它们相连的原子一起形成一个或多个稠合的饱和或不饱和环，该环任选被至少一个卤素、CN、烷基、杂烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-P032-、-L-S0” -L-Rx、反应活性磺酰胺或无反应活性磺酰胺取代。5.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物包含至少一个式IIa所示的反应活性磺酰胺式中R10是H或取代或未取代的C1-C12烷基；或R10和L与和它们相连的氮一起形成饱和或不饱和的环。6.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，R10是H、磺基丙基或磺基丁基。7.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，民是异硫氰酸酯、异氰酸酯、一氯三嗪、二氯三嗪、卤素-取代的吡啶、卤素-取代的二嗪、亚磷酰胺、马来酰亚胺、氮丙啶、磺酰卤、酰卤、羟基琥珀酰亚胺酯、羟基磺基琥珀酰亚胺酯、吡咯-2，5-二酮、四氟苯酚酯、亚胺酯、胼、 叠氮基硝基苯基、叠氮化物、炔烃、3- (2-吡啶基二硫代)-丙酰胺、乙二醛或醛。8.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，民与氨基、巯基或羟基亲核试剂形成共价键。9.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，&、民、1 5和1 9独立选自H、卤10.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R7是H、取代或未取代的烷基或取代或未取代的芳基。11.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R7是被-C02-、羧酰胺、-so”氯、氟或Rx 取代的苯基。12.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，Rx是活化的羧酸酯基团。13.如权利要求12所述的化合物，其特征在于，活化的羧酸酯基团是N-羟基琥珀酰亚胺酯基团。14.如权利要求5所述的化合物，其具有式IIIa所示结构Rlla是H、-SO3^或无反应活性的磺酰胺。15.如权利要求14所述的化合物，其特征在于， R3是H或-SO3-；和L是Qn，其中至少1、2、3或4个Q是-(CH2CH20)-。16.如权利要求5所述的化合物，其具有式IV所示结构式IV17.如权利要求5所述的化合物，其具有式V所示结构18.如权利要求1所述的化合物，其具有式VI所示结构19.式VII所示化合物20.如权利要求19所述的化合物，其特征在于，Z是选自以下的靶离子的螯合剂Ca2+、 Mg2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+、Na+、K+、Hg2+、Pb2+、Cd2+ 或 As3+。21.如权利要求20所述的化合物，其特征在于，Z是基于BAPTA的Ca2+螯合剂。22.—种检测或定量测定金属离子存在与否的方法，包括 a.将样品与式VII所示化合物温育23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述改变是所述化合物的吸收或发射的增加或降低。24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述改变是所述化合物的最大吸收或最大发射波长的改变。25.一种制备标记生物分子的方法，包括将生物分子与具有式VIIIa或Vinb所示结构的化合物反应26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述生物分子是蛋白质、多肽、多核苷酸、 碳水化合物、脂质、金属螯合剂或它们的组合。27.—种试剂盒，其装有i)权利要求1或19所述的化合物；ii本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．式Ｉａ或Ｉｂ所示化合物：式中：Ｘ是Ｏ、Ｓ或－Ｃ（ＣＨ３）２－；Ａ是－ＯＲ１或－ＮＲ１Ｒ１ａ；Ｂ是＝Ｏ或＝Ｎ＋Ｒ４Ｒ４ａ；Ｃ是－ＯＲ４或－ＮＲ４Ｒ４ａ；Ｒ１、Ｒ１ａ、Ｒ４和Ｒ４ａ各自独立为Ｈ或烷基，其是未取代的或用－Ｌ－ＳＯ３－、－Ｌ－ＰＯ３２－、水溶性聚合物或用－Ｌ－Ｒｘ取代；或者一对或多对Ｒ１和Ｒ１ａ或Ｒ４和Ｒ４ａ与和它们相连的氮一起形成饱和或不饱和环，该环任选被－Ｌ－ＳＯ３－、－Ｌ－ＰＯ３２－和－Ｌ－Ｒｘ中的任一个取代；或者Ｒ１、Ｒ１ａ、Ｒ４或Ｒ４ａ中至少一个是酶底物或保护基团；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８和Ｒ９各自独立为Ｈ、卤素、ＣＮ、烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、－Ｌ－ＰＯ３２－、Ｌ－ＳＯ３－、－Ｌ－Ｒｘ、反应活性磺酰胺或无反应活性磺酰胺；或者一对或多对Ｒ２和Ｒ１ａ、Ｒ３和Ｒ４ａ、Ｒ４和Ｒ５、Ｒ５和Ｒ６、Ｒ８和Ｒ９、或Ｒ９和Ｒ１与和它们相连的原子一起形成一个或多个稠合的饱和或不饱和环，该环任选被至少一个卤素、ＣＮ、烷基、杂烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、－Ｌ－ＰＯ３２－、Ｌ－ＳＯ３－、－Ｌ－Ｒｘ、反应活性磺酰胺或无反应活性磺酰胺取代；Ｒ７’是Ｈ、ＯＨ、ＣＮ或Ｃ１－Ｃ６烷氧基；或者Ｒ７’与Ｒ７组合形成５－或６－元螺内酯或螺磺内酯环；Ｒｘ是反应活性基团；Ｌ是键或（Ｑ）ｎ；各Ｑ独立为ＮＲｄ、Ｓ（Ｏ）ｔ、Ｏ、Ｃ（＝Ｘ’）、（Ｃ＝Ｘ’）、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或取代或未取代的杂环烷基，其中ｔ是０－２，不超过两个ＮＲｄ是毗连的，没有两个Ｏ毗连；各Ｘ’独立为ＮＲｄ、Ｓ或Ｏ；ｎ是１－２０；各Ｒｄ是Ｈ、取代或未取代的烷基；只要该化合物包含至少一个反应活性磺酰胺。...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：F·毛，
申请(专利权)人：百奥提姆股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US
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