本发明专利技术提供了二聚体和三聚体核酸染料以及有关的系统和方法。这种染料可形成发夹样结构，该结构使得所述染料通过(例如)请求式释放机理使核酸着色。例如，这种染料在没有核酸存在下的背景荧光低，在有核酸存在下，与核酸结合后的荧光高。本发明专利技术提供的染料可用于各种领域，例如实时PCR中的DNA定量测定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术专利申请是国际申请号为PCT/US2006/009910，国际申请日为2006年3月17日，进入中国国家阶段的申请号为200680008515. X、专利技术名称为“”的专利技术专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2005年3月17日Mao等提交的名为“Dimeric and TrimericNucleicAcid Dyes, and Associated Systems and Methods (二聚和三聚核酸染料以及相关系统和 方法)”的美国临时申请号60/663，613的优先权，本申请与2006年3月16日与本文同时提交的待批美国申请号有关，该待批申请也要求美国临时申请号60/663，613的优先权。上述各份临时申请和上述申请全文纳入本文作为参考。对关于合作研究协议双方名称的声明Biotium, Inc. (Hay ward,加利福尼亚(CA))和 AlleLogic Biosciences Corp.(Hay ward,加利福尼亚)是涉及本专利技术的合作研究协议的双方。序列表和请求书的参考，二者纳为参考上述美国临时申请号60/663，613提交了含本文公开的SEQ ID NO: I到SEQIDNO: 10序列表的原始ASCII软盘和作为该原始软盘副本的另一张ASCII软盘以及该序列表的纸件，该临时申请涉及这些软盘和纸件并将其全文(包括其内容)纳入作为参考。同时提交了该序列表的纸件。据此要求上述美国临时申请号60/663，613已存档的符合规定的(compliant)计算机可读序列表可用于本申请。本申请序列表的纸件或光盘及其内容与上述美国临时申请号60/663，613所提交的序列表计算机可读副本一致。美国临时申请号60/663，613的序列表，同时提交的该序列表纸件和已存档的计算机可读序列表全文(包括其内容)纳入本文作为参考。背景荧光染料已用于检测和分析生物学样品。由于荧光染料灵敏度高，可利用它们来检测非常少量的荧光分子。可利用这种荧光染料检测与细胞相关的不到50个荧光分子。Barak 等，J. Cell Biol. 90，595 (1981)。可用荧光染料作为使活细胞或组织样品成像的探针。例如，利用与网柄菌细胞表面受体结合的荧光染料探针使荧光标记的单分子CAMP成像。Ueda等，Science294,864(2001)。可利用具有不同荧光波长的几种荧光探针在活细胞或组织样品中进行多色成像。与放射性探针相比，荧光探针灵敏度高，毒性较低并易于处理。可用荧光染料检测核酸(包括DNA和RNA)及含核酸的生物学样品。核酸聚合物，例如DNA和RNA参与将遗传信息从一代传递至下一代，以及参与活体的常规机能。因此，核酸令人感兴趣并成为研究目标。能特异性结合核酸并形成具有高度荧光的复合物的荧光核酸是这种研究的有力工具。可利用这些染料检测各种介质，例如纯溶液、细胞提取物、电泳凝胶、微阵列芯片、活的或固定细胞、死细胞和环境样品中是否存在DNA和RNA及其含量。可用这些染料定量检测实时聚合酶链式反应(qPCR)中的DNA，该实时聚合酶链式反应是基因组研究和医学诊断中所用的技术。聚合酶链式反应(PCR)是一种引物延伸反应，它提供一种在体外扩增特定核酸的方法。在PCR期间，反应溶液短时维持于96°C、60°C和72°C这3种温度中的每一种，以分别进行解链或变性、退火和链延伸。利用能快速加热或冷却含反应混合物的试管的自动化热循环仪重复这种三温度时期30或40轮。通过重复该PCR循环，可在数小时内在一种酶促反应混合物中产生DNA样品的百万倍拷贝，从而使得研究人员能测定靶DNA的大小和序列。该DNA扩增技术已用于克隆和其它分子生物学操作。PCR的其它讨论见Mullis等，MethodsEnzymol. (1987)和 Saiki 等，Science (1985)。可用的一种PCR技术是定量实时PCR(qPCR)。简言之，qPCR的机理是以指数方式对靶DNA进行PCR扩增。通过进行PCR反应同时检测扩增反应期间给定时间点的DNA拷贝总数，能追溯计算起始DNA物质的量。荧光DNA检测通常是qPCR所用的一种灵敏、通用以及方便的检测方法。qPCR中使用两种类型的突光试剂。第一种类型以用一种或多种突光染料，或一种突光染料和一种粹 灭染料的组合标记的寡核苷酸为基础。这些标记的寡核苷酸会在与靶序列杂交后，或杂交接着切割寡核苷酸后，以与存在的DNA量成比例的方式发出荧光。各种专利和出版物描述了寡聚荧光试剂的机理和应用。参见，例如Holland等，Proc. Natl. Acad. Sci USA(1991)；Lee 等，Nucleic Acids Res. (1993);和美国专利号 5，210，015 ;5，538，848 ;6，258，569 ;5，691，146 ;5，925，517 ;5，118，801 ;5，312，728 和 6，635，427。虽然 qPCR 的寡聚荧光试剂的优点在于对靶序列高度特异，但它们的设计非常复杂，因而使用昂贵。qPCR所用的第二种类型的荧光试剂以通常称为荧光核酸染料或染色剂的DNA结合荧光染料为基础。由于荧光核酸染料是较简单的分子，它们易于制备，因此使用廉价。它们在qPCR中的应用是用于研究实验室的常规遗传检测。不是所有常规可用的荧光核酸染色剂都能用于qPCR。为适用于qPCR，理想地，荧光核酸染料应符合某些标准。首先，其在PCR和保存期间应是化学稳定的。由于PCR在高温下进行，所述染料应对热稳定。此外，由于PCR所用的Tris缓冲液的pH可从在低温下(4°C )为碱性(pH 8. 5)，显著变化至在高温下为中性或微酸性，所述染料应能耐受酸或碱辅助的分解作用。其次，当存在于PCR溶液中时，所述染料不应抑制PCR过程。第三，在无DNA存在时，所述染料应没有荧光或荧光极低，有DNA存在时，应变得有高度荧光。第四，所述染料应能吸收或发出与现有仪器相容的波长，所述仪器通常装配了为以下常规荧光染料优化的光通道(optical channel):例如FAM、J0E、VIC(Applied Biosystems,Foster City,加利福尼亚)、TAMRA、R0X、德克萨斯红、Cy3和Cy5。第五，所述染料结合DNA时，序列偏好应低或没有。第六，DNA-染料复合物应具有与存在的DNA含量线性相关的荧光强度。考虑到上述标准，就不奇怪可用于qPCR的核酸结合染料极少。溴化乙锭(EB)是一种DNA染料，已用其证明了 qPCR使用简单染料的可行性。Higuchi等，Bio-Technol10 (4) ,413(1992)。然而，EB的问题是灵敏度低和波长不理想。qPCR广泛使用的染料是Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oregon (OR))的 SYBR 绿 I。Wittwer 等，Biotechniques22 (I), 130 (1997) ο SYBR绿I是环状取代的不对称花青染料。Zipper等，Nucleic AcidsRes. 32(12)，el03 (2004);和美国专利号 5，436，134 和 5，658，751。SYBR 绿 I 的优点在于它能激本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有下式的化合物：其中：Q1是荧光核酸染料成分；Q2是荧光核酸染料成分；Q1和Q2可以是相同或不同的；其中(i)Q1和Q2各自独立是具有式II所示结构的不对称花青染料：式II式II中，R1“是H；具有包括端点的1个碳?6个碳的烷基或烯基；卤素；?OR9；?SR10；?NR11R12；?CN；?NH(C=O)R13；?NHS(=O)2R14；?C(=O)NHR15；与小沟结合有关的取代基；或表示桥与该结构相连之处；当式II中的R1’包括R9、R10、R11、R12、R13、R14和R15中至少一个时，R9、R10、R11、R12、R13、R14和R15中任何一个所述基团独立为H；任选含有包括端点的1?2个氮且具有包括端点的1个碳?12个碳的烷基；或芳基；当式II中的R1’包括R11和R12时，R11和R12可组合形成5?或6?元饱和或不饱和环，该环可任选含有至少一个选自N和O的杂原子；式II中的X选自O和S；式II中的n选自0、1和2；式II中的R6是H；任选含有至少一个选自N、O和S的杂原子，具有包括端点的1个碳?10个碳的烷基或烯基；卤素；?OR16；?SR16；?NR16R17；任选含有包括端点的1?3个选自N、O和S的杂原子的取代或未取代芳基；或表示桥与该结构相连之处；式II中的R7是H；任选含有芳基和至少一个选自N、O和S的杂原子，具有包括端点的1个碳?10个碳的烷基或烯基；任选含有包括端点的1?3个选自N、O和S的杂原子的取代或未取代的芳基；或表示桥与该结构相连之处；式II中的R8和R8’组合形成稠合芳环，该芳环还可独立地用包括端点的 C1?C2烷基、包括端点的C1?C2烷氧基、包括端点的C1?C2烷基巯基或卤素取代包括端点的1?4次；所述R16和R17各自独立为H；或任选含有1?2个氮，具有包括端点的1个碳?12个碳的烷基；或芳基；R16和R17可组合形成5?或6?元饱和或不饱和环，该环可任选含有至少一个选自N和O的杂原子；式II中的R1’、R6、和R7中只有一个表示桥与该结构相连之处；和式II中的Ψ是阴离子；或(ii)Q1和Q2各自独立地是具有式III的结构的吖啶染料：式III其中，式III中的各R1独立为H或包括端点的C1?C2烷基；式III中的R2和R3之一表示桥与该结构相连之处；当式III中的R2表示桥与该结构相连之处时，R3是H或?CH3；当式III中的R3表示桥与该结构相连之处时，R2选自H、?CH3、?NH2、?NHCH3、?CN和?C(=O)NH2；式III中的各R6独立为H或包括端点的C1?C2烷基；式III中的各R7独立为H或包括端点的C1?C2烷基；对于各对毗邻的R6或R7和R1，R6或R7和R1可独立组合形成5?或6?元饱和或不饱和环；和式III中的Ψ是阴离子；和桥是含有约8至约150个非氢原子的实质上脂族的接头，并且该接头包含不超过一个正电荷。FDA00002376240300011.jpg,FDA00002376240300012.jpg,FDA00002376240300021.jpg...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：F·毛，W·Y·里昂，X·辛，
申请(专利权)人：百奥提姆股份有限公司，阿莱罗杰克生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。