一种能定量检测扩增过的核酸的高灵敏度同相方法。用高亲合性荧光染料可在扩增期间或扩增后进行检测。所述染料选自非对称花青染料类，具有至少两个正电荷和在从约１×１０↑［４］到约５×１０↑［５］（摩尔浓度↑［－１］），范围内的结合常数（Ｋｂ）。用于试验的试剂可以包含在为扩增例如经聚合酶链反应所设计的试剂盒中。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测靶双链核酸的同相检测法。该方法可用于各种诊断、调查和研究程序中，特别是用于感染因子的检测。本专利技术还涉及可用于该检测法的试验药盒。近年来，已逐步将检测核酸作为一种早期检测基因组特征，感染因子及以小量存在于人或动物试验标本中的各种生物的手段。检测方法一般是基于两条DNA链借助互补核苷酸之间的氢键和其他力而结合在一起的互补原理(称为核苷酸对)。正常情况下，DNA分子是相当稳定的，但在某些条件下，如加热，可使两条链分离或变性。变性的核苷酸链将只能与具有互补核苷酸序列的另一条链重新结合。为找到只检测少数DNA分子的方法，已进行了许多研究工作。各种方法是已知的并使用了近十年，它们只是扩增或大大增加待检样品中的核苷酸数目。这些扩增技术包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)和研究较少的其他一些方法。PCR是最为人们所熟知的，包括在适当条件下，于DNA聚合剂及三磷酸脱氧核糖核苷酸存在的条件下，使引物与靶核酸链杂交。经过几个循环后的结果是形成引物延伸产物并使原有的靶链数目以指数扩增。有关PCR的进一步细节可参见US-A-4,683,195(Mullis等人)，和US-A-4-,683,202(Mullis)和US-A-4,965,188(Mullis等人)。尽管象PCR这样的扩增方法为检测小量靶核酸提供了机会，但同时也产生一个问题，即寡核苷酸从一个容器到另一容器时，会产生人为的污染。由于污染物会随新样品的靶核酸同时被扩增而得到假阳性结果。这样可能产生严重的后果，特别是在检查感染因子时。认为工业上的物理封闭和化学“消毒”技术可降低这种污染。物理封闭手段有其优点，但在反应容器的加工和设计上还是相当复杂的。化学消毒技术在本领中论述过，但尚未得到成功地证明。有必要寻找一种方法以简化扩增方法，同时又不必担心物质从一个容器到另一个容器的过程中受到污染。还需要一种实质上可定量的扩增方法。所述方法可用于治疗疾病而不仅仅是对其的检测。EP-A-0487218(Tosoh 1992年5月27日公开的)中描述了被认为实质上是定量的同相扩增方法，其中在扩增期间或扩增之后使用特定的荧光染料与双链DNA结合。结合后，荧光信号的改变水平显然是与标本中靶核苷酸的量相关联的。认为可用于Tosoh公开文本中的几类荧光素染料是溴化乙锭。吖啶橙、二苯并咪唑(如Hoechst 33258)，二氨基苯基吲哚，放线菌素，噻唑橙和色霉素。“同相”是指该方法不需要将被检测的靶核酸同非靶材料分开。相同类型的染料也可用于检测DNA聚合酶，如US-A-5,049,490(Sutherland等人)中描述的。尽管上述染料(如溴化乙锭和Hoescht染料)很容易与DNA结合，但由于显著的敏感性，从而使使其显现的本底通常太高。因此，需要找到既与DNA易结合，又有较高敏感性和较低本底的染料。已经由Mansfield等人(BioTechniques 15(2)，p274-279(1993))描述了用于着染扩增的核酸的敏感染料—某些双—嵌入染料。虽然上述染料可用于着染核酸并克服了上述的本底问题,但它们与核酸的结合太紧以致抑制了扩增过程。因此，它们只能在扩增终止时而不是在该过程中使用。需要一种更敏感的同相检测法，它可用于封闭系统中扩增的靶核酸的定量检测，由此避免污染问题。所述检测法应对于低水平核酸是高度敏感的，并易于操作和使用。此外，还需用掺入的检测工具来监测扩增进程，以便使之在扩增期间存在。已用检测双链靶核酸的同相检测法克服了上述问题，该方法包括下述步骤A)扩增双链靶核酸B)使所得到的扩增的双链靶核酸与荧光染料接触，该染料与双链靶核酸结合时，与染料同双链核酸靶核酸的单链结合所产生的信号相比，或与游离形式的染料的信号相比，呈现出可检测信号，以及C)检测或监测作为确定双链靶核酸之存在或其数量标准的可检测信号，因而荧光染料是一种非对称的花青染料，与双股核酸的结合常数(Kb)为从约1×104至5×105，并由结构式(I)代表 其中X是-S-、-O-、-Se-、＝CH-或-NR1-，Y是-CH＝CH-，R是有1至6个碳原子的烷基，R1是氢或有1至6个碳原子的烷基，R2和R6分别是有1至10个碳原子的亚烷基，R3、R4和R5分别是有1至6个碳原子的烷基，Z1包括形成一个5或6元杂环所需的碳原子和杂原子，该杂环可有多达3个融合于其上的芳族碳环或杂环，Z2包括形成5或6元芳环所需的碳和杂原子，所述芳环可有多达2个融合于其上的芳族碳环或杂环，Q是酸阴离子，n是0、1或2，m、p和q分别是0或1，条件是p和q不相同，r是1或2，且t是0、1或2，从而可在扩增的双链靶核酸不与俘获探针结合情况下进行检测或监测。本专利技术还提供一种监测双链靶核酸扩增的方法，包括以下步骤A)在荧光染料存在的情况下扩增双链靶核酸，当荧光染料结合于双链靶核酸上时，与染料同双链靶核酸的单链结合时所产生的信号，或与其游离形式的信号相比，表现出可检测的信号，并且B)在扩增过程中，按双链靶核酸的存在情况和其数量检测或监测可检测信号。因而该荧光染料在前述方法中是如上所述的染料，并从而不必使扩增的双链靶核酸与俘获探针结合就可进行检测或监测。更进一步，本专利技术提供一种进行同相扩增并检测双链靶核酸的试验药盒，该药盒以相同或不同的包装包括1)荧光染料，与双链靶核酸结合时，同染料与双链靶核酸的单链结合时所产生的信号，或其游离形式的信号相比，表现出可检测的信号，从而按上述本专利技术方法使用该荧光染料，并且2)至少一种扩增试剂。本专利技术提供了一种较简单、高度敏感的同相检测法，它用于在扩增期间或其后检测靶核酸。因此，该方法可用于在扩增过程中的任何给定点上定量监测扩增和核酸的量。也可以用于在扩增终止时检测核酸的量。因为该方法是同相的，故其可在任何适当的容器中进行，而不需要如异相方法中常见的分离和俘获步骤。因为在扩增后不需要从反应容器中除去试剂，故可避免从一个容器到另一个容器所造成的污染。更重要的是，因为本底信号较低，所以该检测法比先前报导的使用常用荧光染料的检测法更为敏感。这些优点是因使用特定类型的荧光染料而达到的，这些荧光染料对被扩增的和在特定范围内检测的双链核酸有高度的亲和性。这种结合亲和性比许多常用荧光染料更大，但又不致于大到抑制靶核酸扩增的程度。染料至少是二价的，即每个分子至少有两个阳电荷。对这些染料的更详细的限定详见下文。附图是荧光强度对PCR循环的曲线图，对该图内容的解释详见下文实施例1。使用聚合链反应扩增和检测核酸的一般原理和条件是众所周知的，其详细介绍可参见US-A-4,683,195、US-A-4,683,202和US-A-4,965,188等大量参考文献，所有这些文献均列为本文参考文献。因此，鉴于本领域中的技术教导和本文提供的特定教导，本领域技术人员通过调整本文教导的方案扩增一个或多个核酸以实践本专利技术应是没有困难的。可用于实践本专利技术的其他扩增方法包括例如EP-A-0320308(1987年12月公开的)和EP-A-0439182(1990年1月公开的)中描述的连接酶链反应、例如Birkenmeyer等人(J.Virol.Meth.35，pp.117-126(1991))所述的自身支持的序列复制(self-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测双链靶核酸的同相方法，包括以下步骤： （Ａ）扩增双链靶核酸， （Ｂ）使所形成的扩增过的双链靶核酸与荧光染料接触，当所述染料结合到所述双链靶核酸上时，与其结合到所述双链靶核酸的单链上产生的信号或者染料在其自由状态下产生的信号相比较，能显示出可检测的信号，和 （Ｃ）检测或测定所述可检测的信号，以测定所述双链靶核酸的存在或数量， 其中，所述荧光染料是不对称花青染料，与双链核酸的结合常数（Ｋｂ）从约１×１０↑［４］至５×１０↑［５］（摩尔浓度↑［－１］），具有结构式Ⅰ所代表的结构： ＊＊＊ 其中Ｘ是－Ｓ－、－Ｏ－、－Ｓｅ－、＝ＣＨ－或－ＮＲ↑［１］－ Ｙ是－ＣＨ＝ＣＨ－， Ｒ是１至６个碳原子的烷基， Ｒ↑［１］是氢或１至６个碳原子的烷基， Ｒ↑［２］和Ｒ↑［６］分别是１至１０个碳原子的亚烷基， Ｒ↑［３］、Ｒ↑［４］和Ｒ↑［５］分别是１到６个碳原子的烷基， Ｚ↑［１］包括构成５或６员杂环必需的碳原子和杂原子， Ｚ↑［２］包括构成５或６员芳环必需的碳原子和杂原子， Ｑ是酸阴离子， ｎ是０、１或２， ｍ、ｐ和ｑ分别是０或１，条件是ｐ和ｑ不相同， ｒ是１或２，和 ｔ是０、１或２， 其中所述的检测或测定在所述扩增过的双链靶核酸不杂化成捕获探子的情况下进行。...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：JW苏瑟兰，DR帕特森，
申请(专利权)人：临床诊断系统公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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