本发明专利技术公开了分离自产蛋下降病鸡的鸡黄病毒CJD05株，保藏在CCTCC，保藏日期2011年7月29日，保藏编号：CCTCC?V201126。本发明专利技术还公开了鸡黄病毒分离株在制备鸡黄病毒病疫苗上的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及鸡黄病毒病疫苗的制备方法及在鸡黄病毒病防制中的应用。
技术介绍
鸡黄病毒病是2009年以来在我国首先出现的一种新疫病，临床特征主要表现为产蛋鸡发热、产蛋急降或停止、采食减少或食欲废绝为；剖检特征主要表现为卵泡出血、萎缩，部分卵黄破裂，形成卵黄性腹膜炎。该病主要侵害产蛋(种)鸡，给我国蛋(种)鸡养殖业造成很大经济损失。福建省农业科学院畜牧兽医研究所在国内外首先分离、鉴定了鸡黄病毒(Chicken Flavivirus, CFV)，确认CFV是鸡黄病毒病的病原，是黄病毒科黄病毒属的新成员，丰富了动物病毒学内容。建立了检测鸡黄病毒病抗原的RT-LAMP方法和检测抗体的微量血清中和方法，制备的疫苗可有效预防鸡黄病毒病。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供鸡黄病毒CJD05株分离自产蛋下降病鸡的鸡黄病毒CJD05株，保藏在中国典型培养物保藏中心 (China Center for Type Culture Collection，简称 CCTCC)，保藏日 2011 年 7 月 29 日，保藏编号CCTCC V201U6。保藏单位CCTCC地址在中国武汉市武汉大学。本专利技术的目的之二是提供鸡黄病毒CJD05株应用于鸡黄病毒病疫苗的制备方法， 将上述的鸡黄病毒分离株在番鸭胚或鸡胚尿囊腔中增殖，收获死胚尿囊液经甲醛灭活并超滤浓缩后，按适当比例与油佐剂混勻，研制成安全有效的鸡黄病毒病灭活疫苗，并应用于该病的防制。本专利技术的创新点在于，鸡黄病毒病是2009年以来新出现的疫病，至今还无法预防和控制，本专利技术在明确病原的基础上，在国内外率先将鸡黄病毒分离株应用于制备疫苗，并研制成安全有效的鸡黄病毒病灭活疫苗，为该病防制提供了技术支撑。具体实施例方式以下结合具体实施例对本专利技术进一步说明(但不是对本专利技术的限制)。分离自产蛋下降病鸡的鸡黄病毒CJD05株，能在9日龄鸡胚、12日龄番鸭胚和 MDEF细胞中稳定增殖，并能致胚胎死亡和细胞病变，具有如下特性CJD05株经尿囊腔接种 12日龄番鸭胚，其ELD5tl彡IO-4 VO. Iml ；对番鸭胚成纤维单层细胞TCID5tl彡10_4 5/0· Iml ； 该毒株保藏在CCTCC，保藏日2011年7月四日，保藏编号CCTCC V201U6。上述鸡黄病毒CJD05株应用于鸡黄病毒病疫苗的制备方法如下1、病毒增殖将鸡黄病毒CJD05株用灭菌Hanki^fl 10稀释后，经尿囊腔途径接种12日龄番鸭胚或9日龄鸡胚，0. Iml/枚，37°C温箱培养，每日观察2次至第7天，弃去 24h内的死胚，胚胎濒死时置4°C冰箱4小时以上，收获死胚尿囊液，-20°C冻存。2、病毒含量ELD50测定取上述尿囊液毒以Hank’ slO倍系列稀释后，经尿囊腔接种12日龄番鸭胚或9日龄鸡胚，每稀释度接种4枚，0. IML/胚，置37°C继续孵化，观察7天， 弃除M小时内的死胚，计算ELD5tlt5当尿囊液毒ELD5tl彡10_4_°/0. Iml时，可用于病毒灭活。3、病毒灭活和浓缩将收获的尿囊液，加入终浓度为0. 的甲醛，37°C 24h灭活， 经适当超滤浓缩后即为制备疫苗用的抗原，37 °C保存备用。4、灭活验证取灭活并浓缩后的抗原接种9日龄SPF鸡胚或12日龄番鸭胚， 0. Iml/胚，37°C温箱继续孵化，观察7天，除接种后Mh内死亡的胚胎外，接种胚应全部存活。5、疫苗配制，按1 1 1.5的比例加入灭活抗原和油佐剂，搅拌均勻制成油包水型乳剂疫苗。6、疫苗主要指标测定6. 1无菌检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行，应无菌生长。6. 2安全性测定用27周龄健康易感的产蛋高峰期海兰褐蛋鸡30羽，随机分成2 组，每组15羽。试验组每羽颈部皮下注射5ml疫苗；对照组每羽腿部肌肉注射5ml Hanks 液，隔离饲养并观察20天。接种鸡全部存活，且采食、饮水、精神状态等均未见异常，试验组产蛋率与对照组无统计差异，接种后10天和20天各随机剖杀3羽，内脏器官、卵泡、卵巢和输卵管等也未见异常。6. 3免疫力测定(免疫抗体、攻毒保护力)6. 3. 1试验设计取12周龄海兰褐蛋鸡40羽，随机分成免疫组和对照组。免疫组每羽颈部皮下接种疫苗lml/1羽份，对照组每羽颈部皮下注射Hanks液Iml ；间隔4周，取经上述免疫的16周龄蛋鸡同剂量颈部皮下加强免疫一次。分别于首次免疫后14天、观天和加强免疫后7天(首免后35天，即17周龄，以此类推)、14天、21天、观天、42天、56天、77 天、90天采血，测定免疫后不同时间的中和抗体效价，评价疫苗诱导的抗体水平。同时，取二免后35天(即21周龄)的免疫组和对照组蛋鸡各10羽，经口、鼻和肌注攻击强毒，1.0ml/ 羽，观察20天，记录各组蛋鸡的饮食欲、精神状态及产蛋数量，评价疫苗的攻毒保护力。6. 3. 2血清中和抗体结果从表1可知，蛋鸡首免后14天部分免疫鸡血清中出现较低水平的中和抗体，首免后观天中和抗体达22 ；二免后14天中和抗体水平为23，随后逐渐上升，二免后观天达24 5，直到90天抗体水平仍维持较高水平(24 3)。表1 12周龄蛋鸡疫苗免疫后血清中和抗体水平动态变化(Log2)权利要求1.分离自产蛋下降病鸡的鸡黄病毒CJD05株，保藏在CCTCC，保藏日期2011年7月四日，保藏编号CCTCC V201126o2.根据权利要求1所述的鸡黄病毒CJD05株在制备鸡黄病毒病疫苗上的应用。全文摘要本专利技术公开了分离自产蛋下降病鸡的鸡黄病毒CJD05株，保藏在CCTCC，保藏日期2011年7月29日，保藏编号CCTCC V201126。本专利技术还公开了鸡黄病毒分离株在制备鸡黄病毒病疫苗上的应用。文档编号A61P31/14GK102329782SQ201110235230公开日2012年1月25日 申请日期2011年8月16日 优先权日2011年8月16日专利技术者俞伏松, 朱小丽, 李兆龙, 林锋强, 江斌, 王劭, 程晓霞, 陈仕龙, 陈少莺 申请人:福建省农业科学院畜牧兽医研究所本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．分离自产蛋下降病鸡的鸡黄病毒ＣＪＤ０５株，保藏在ＣＣＴＣＣ，保藏日期２０１１年７月２９日，保藏编号：ＣＣＴＣＣ Ｖ２０１１２６。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈少莺，陈仕龙，林锋强，俞伏松，程晓霞，王劭，朱小丽，李兆龙，江斌，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：35
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