本发明专利技术涉及一种IBDV?HQ株CGMCC?NO.4935及传染性法氏囊病灭活疫苗和联苗的制备方法。其主要包括：①细胞种子链扩增；②在消毒后的生物反应器中加入细胞生长液，接种制苗用细胞进行悬浮培养；③细胞长至最大密度时更换含传染性法氏囊病毒毒种的维持液，继续培养；④适时收获病毒，并测定毒价；⑤灭活病毒液，按不同的配比制备传染性法氏囊病灭活疫苗及其联苗。本发明专利技术方法可使细胞密度增加，病毒滴度提高；疫苗效价提高、副反应减少；降低劳动强度，减少了生产成本；提高了生产过程的可控性，保证了产品质量的均一稳定；生产出的传染性法氏囊病灭活疫苗及其联苗安全性好、免疫效力高，对法氏囊强毒攻击具有完全的保护作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及兽用生物制品
，具体涉及一种传染性法氏囊病病毒及用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病病毒制备灭活疫苗和联苗的方法。
技术介绍
传染性法氏囊病毒Qnfectious Bursal Disease Virus, IBDV)属双股 RNA 病毒科，双股RNA病毒属，是一种主要侵害3 12周龄的雏鸡与青年鸡的高度接触性传染病，该病原主要破坏鸡的中枢免疫器官一法氏囊，造成机体的免疫抑制，导致感染雏鸡死亡和对 (其他)致病因子的感染性增加、对(其他)疫苗的免疫应答能力下降，给养禽业造成严重的危害。目前，该病主要通过疫苗接种来防控。除给雏鸡使用活疫苗免疫外，通常还给种鸡注射灭活疫苗使雏鸡获得高的母源抗体，以保护其在生命早期不感染传染性法氏囊病病我国目前传染性法氏囊病灭活疫苗及其联苗的生产主要采用传统的转瓶原代细胞(成纤维细胞)培养病毒液。转瓶原代细胞(鸡胚成纤维细胞)培养法是培养细胞贴壁生长于玻璃培养瓶内壁上，虽然其操作技术要求较低和技术成熟稳定，但与当前大规模动物疫苗生产不相适应，主要表现为(1)传染性法氏囊病病毒在鸡胚成纤维细胞上增殖滴度不高，需要加大浓缩倍数，增加生产成本，所以在实践中应用效果差；(2)转瓶鸡胚成纤维细胞培养，不能做到培养条件适时调整，无法保证细胞培养处于最佳条件，因而培养细胞密度小、病毒繁殖的滴度低、鸡只免疫后的效果差、副反应大；C3)转瓶培养细胞生产过程不完全可控，细胞批间差异大，产品质量的不均一、不稳定；(4)转瓶培养细胞劳动强度大、 生产效力低；(病毒液需加大浓缩倍数后才能制成合格疫苗，生产成本高；)(5)存在鸡胚源外源病毒污染的生物安全隐患。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种由超强毒经培育、训化的传染性法氏囊病细胞毒HQ株，并提供了用激流式生物反应器代替传统的转瓶繁殖法氏囊病毒液制备IBDV灭活疫苗的方法，其制备出的灭活疫苗安全性好、免疫效力高，对传染性法氏囊病强毒攻击具有完全的保护作用，且生产成本大为降低。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是一种传染性法氏囊病毒HQ株，其保藏编号为CGMCC NO. 4935。上述传染性法氏囊病毒HQ株在制备传染性法氏囊病病毒疫苗中的应用。一种用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病毒液制备灭活疫苗的方法，包括以下步骤(1)细胞种子链的扩增，即用细胞生长液在方瓶或转瓶中培养制苗用细胞；(2)在消毒后的激流式生物反应器中加入细胞生长液，接种上步所得制苗用细胞进行悬浮培养；(3)悬浮培养一定时间后向上述激流式生物反应器中接种含传染性法氏囊病毒 HQ 株 CGMCC NO. 4935,继续培养；(4)接毒后22 2 后，即当耗糖量降至0或近似0时，即视细胞绝大多数已病变后收获病毒，反复冻融灌注袋内细胞1 3次，收获全悬液毒液，测定毒价；(5)灭活上步所得病毒液(加入10%甲醛溶液，随加随摇，直至溶液中的甲醛终浓度为0. 1%，置37°C灭活16小时，得传染性法氏囊病水相)，并按规定的配比制得传染性法氏囊病病毒疫苗。在所述步骤O)中，在IOL的反应器(AP20)中接种约6X IO9个的细胞数，培养温度为37 39°C。在所述步骤(3)中，在接种细胞后4 5天，悬浮培养至细胞耗糖量最大时(约 2g/lV24h)，以替换细胞生长液的形式向所述生物反应器的维持液中接入一定量的MOI为 0. 5 0. 9传染性法氏囊病毒HQ株CGMCC NO. 4935毒种，37 °C下继续培养。所述维持液含98% DMEM/F12、2%胎牛血清、100U/ml抗菌素，其pH 7. 2 7. 3、D0 30% 50% (溶氧)。所述步骤(1)、(2)中的细胞生长液含90% DMEM/F12、10%胎牛血清、90 100U/ ml抗菌素，其pH 7. 2 7. 3、DO (溶氧)体积百分含量30% 60%。所述激流式生物反应器为Amprotein AP-20C或/和Amprotein AP-10C。所述制苗用细胞为鸡胚源细胞系DF-I (购自美国ATCC公司)。步骤( 所述传染性法氏囊病病毒疫苗为传染性法氏囊病灭活疫苗、鸡新城疫-传染性法氏囊病二联灭活疫苗、鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊病三联灭活疫苗、鸡新城疫-传染性支气管炎-减蛋综合征-传染性法氏囊病四联灭活疫苗中的任意一种或多种。本专利技术具有积极有益的效果1.传染性法氏囊病毒HQ株是上世纪90年代初从发病鸡群中分离的，是一株典型的具代表性的超强毒株，后经鸡胚囊源细胞、鸡胚肾细胞、鸡胚成纤维细胞多次传代后致病性减弱，对细胞的适应性大大增强。经培育、训化而成的细胞毒HQ株具有良好的免疫原性， 是一株经过鉴定的优秀的制苗毒株。2.本专利技术利用激流式生物反应器纸片载体、激流溶氧和补糖，及先进的控制系统，可最大限度地提高反应器中单位体积细胞的生长密度，在疫苗生产中具有很大的潜力和优势，具体表现为(1)细胞密度大大增加，病毒滴度极大提高，TCID50 ^ 10_8 70. Iml ； (2)疫苗效价大大提高，副反应减少；(3)降低了劳动强度，减少了人力、物力和占地面积， 大大降低了生产成本；(4)连续、封闭式的病毒培养方式，提高了生产过程的可控性，保证了产品质量的均一、稳定；( 进一步降低了疫苗生产的安全隐患，更符合疫苗生产的GMP 要求，因而具有广阔的发展前景。利用本专利技术生产的传染性法氏囊病灭活疫苗及其联苗的安全性好、免疫效力高，对传染性法氏囊强毒攻击具有完全的保护作用。本专利技术所述传染性法氏囊病毒infectious Bursal Disease Virus，IBDV)HQ株， 已于2011年6月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为 CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该传染性法氏囊病毒的保藏编号为CGMCC NO. 4935。本专利技术所述产蛋下降综合征病毒Z16株，已于2011年6月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该产蛋下降综合征病毒的保藏编号为CGMCC NO. 4934。具体实施例方式为了使本专利技术更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解， 这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限止本专利技术的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。实施例1 HQ毒株的分离、培育、鉴定过程上世纪90年代初期，国际上流行的传染性法氏囊超强毒传入中国，引起未免疫的雏鸡大批发病和死亡，死亡率高达40 60%。专利技术人于1992年6月在河南郑州郊区的一个从暴发传染性法氏囊病的鸡场中收取鸡亡鸡只的法氏囊进行病毒分离，得超强毒株，经鸡胚囊源细胞、鸡胚肾细胞、鸡胚成纤维细胞多次传代、训化后，细胞毒致病性减弱，对细胞的适应性大大增强，在成纤维细胞上的毒价，TCID5tl彡10_6 70. Iml ；在DF-I细胞上的毒价， TCID5tl彡10_7_°/0. 1ml，明明为HQ株；HQ株细胞毒经克隆纯化和外源病检测后，于2000年初委托中国兽医药品监察所作毒价检验，结论认为符合《鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、传染性法本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种传染性法氏囊病毒ＨＱ株，其保藏编号为ＣＧＭＣＣ ＮＯ．４９３５。
【技术特征摘要】
1.一种传染性法氏囊病毒HQ株，其保藏编号为CGMCC NO. 4935。2.权利要求1所述的传染性法氏囊病毒HQ株在制备传染性法氏囊病病毒疫苗中的应用。3.一种用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病毒制备灭活疫苗的方法，包括以下步骤(1)细胞种子链的扩增，即用细胞生长液在方瓶或转瓶中培养制苗用细胞；(2)在消毒后的激流式生物反应器中加入细胞生长液，接种上步所得制苗用细胞进行悬浮培养；(3)悬浮培养一定时间后向上述激流式生物反应器中接种含传染性法氏囊病毒HQ株 CGMCC NO. 49；35，继续培养；(4)接毒后22 2 后，即当耗糖量降至0或近似0时，收获病毒，反复冻融灌注袋内细胞1 3次，收获全悬液毒液，测定毒价；(5)灭活上步所得病毒液，并按规定的配比制得传染性法氏囊病病毒灭活疫苗。4.根据权利要求3所述的用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病毒制备疫苗的方法，其特征在于，在所述步骤⑵中，每IOL的反应器中接种6X IO9个的细胞数，培养温度为 37 39°C。5.根据权利要求3所述的用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病毒制备疫苗的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，在接种细胞后4 5天，悬浮培养至细胞耗糖量最大时，以替换细胞生长液的形式向所述生物反应器的维持液中接入一定量的MOI为0. 5 0. 9 的传染性法氏囊病毒HQ株CGMCC N...
【专利技术属性】
技术研发人员：王泽霖，王川庆，赵军，陈陆，王新卫，杨霞，常洪涛，王雷，周欣，余彬辉，宋羚羚，高焕河，
申请(专利权)人：河南农业大学禽病研究所，
类型：发明
国别省市：41
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