一种DNA克隆方法技术

一种DNA克隆方法，涉及一种DNA克隆方法。在载体插入位点处用限制性内切酶消化载体获线形载体DNA；根据目的DNA片段和载体插入位点处序列设计合成PCR扩增引物，再PCR扩增，获目的DNA片段；纯化线形载体DNA和目的DNA片段，再混合，并加入核酸外切酶III和核酸外切酶III反应缓冲液组成反应体系，继续反应，加入乙二胺四乙酸二钠以终止反应，再反应后，退火；从反应体系中取转化大肠杆菌E.coli感受态细胞；将转化菌液涂布含相应抗生素的LB培养基平板培养；从培养平板中挑取单克隆菌落，提取质粒进行鉴定，以确定目的DNA片段的成功克隆。不依赖限制性酶切位点和连接酶，能实现DNA片段快速高效克隆。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种DNA克隆方法，尤其是涉及一种由核酸外切酶III介导的无需连接反应的目的DNA片段高效克隆方法。
技术介绍
目前基因工程中采用的分子克隆方法是依赖于限制性内切酶和连接酶的方法，即先由限制性内切酶获得带互补粘性未端或平末端的目的DNA片段和载体DNA片段；然后，通过连接酶的连接反应将载体和目的DNA片段重新连接成一个环状的质粒DNA，最后将该环状质粒DNA转化大肠杆菌以获得含目的DNA片段的克隆。这种常规的分子克隆方法依赖限制性内切酶识别序列，因为被限制性内切酶酶切后，载体DNA和目的DNA片段必须产生能互补的粘性末端或平末端，才能完成后续的连接反应。然而，由于载体DNA和目的DNA片段能共同利用的酶切位点往往较少，这就使得有些DNA片段的克隆由于找不到合适的酶切位点而需要经过几步亚克隆过程才能获得所需的重组质粒，整个过程耗时耗力。如果目的DNA 片段为基因序列，那么为了能使接入载体的目的基因阅读框架不发生改变经常还需要煞费苦心地添加一些碱基，这使得所表达的蛋白N端往往多添加了几个氨基酸而有可能使蛋白的特性发生改变。再者，由于常规的分子克隆方法连接载体和目的DNA片段依赖连接酶催化的连接反应，因此增加了载体的自连机率，加大了筛选工作量。另外，传统的克隆方法很难将长片段DNA接入一个大分子量载体中，这主要在于经由限制性内切酶处理获得的粘性未端一般只含有四、五个碱基，这几个碱基很难维持大片段和大载体间形成的亚稳定开环 DNA复合体而造成大片段DNA连接困难；采用常规的分子克隆方法通常很难一次完成多片段的连接反应，这使得多片段的连接往往需要经历几步亚克隆过程，而且即使经历几步亚克隆过程，目的基因还经常以相反的方向接入载体而造成假阳性。因此，为了提高目的DNA 片段克隆的成功率，节省克隆所需时间，很有必要建立一种快速、高效、稳定，同时能提高长片段基因克隆率并实现多片段DNA —次性无痕连接的基因克隆方法。核酸外切酶111(即Exonuclease III，以下简称ExoIII或外切酶III)是一种非特异性的外切酶，它具有从双链DNA 5’突出末端或平末端沿3’ 一5’方向逐步切去单核苷酸的外切酶活性，但不具有从3’突出末端消化双链DNA的外切酶活性。利用该酶的这种外切酶活性对含同源序列的线性载体和目的DNA片段进行处理，即可分别在载体DNA和目的DNA片段上产生能互补的长粘性未端，这种带互补长粘性未端的载体和目的DNA片段，经退火后能形成稳定的开环DNA复合体，这种DNA复合体往往带缺口或突出序列W、ASlanidiS C,de Jong P J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acid Res,1990, 18 :6069-6074 ；5、Yang Y S,Watson W J,Tucker P W et al. Construction of recombinantDNA by exonuclease recession. Nucleic Acids Res. 1993,21 :1889-1893 ;6、Li C and Ronald M. Evans. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research, 1997,25(20) :4165-4166]。但是这种带缺口和突出序列的DNA复合体转化大肠杆菌后，能被大肠杆菌细胞的修复系统修复，形成完整的环状质粒DNA，从而完成目的DNA片段的克隆(6、Li C and Ronald Μ. Evans. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research, 1997,25(20) :4165-4166 ；7> Baogong Zhu, Guifang Cai, Emily 0. Hall, et al. In-Fusion assembly :seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques, 2007,43(3) :354-359)。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种DNA克隆方法，该方法不依赖限制性酶切位点和连接酶，能实现DNA片段快速高效克隆。本专利技术包括以下步骤1)在载体插入位点处用限制性内切酶消化载体，获得线形载体DNA ；2)根据目的DNA片段和载体插入位点处序列设计合成PCR扩增引物；3)用所合成的PCR扩增引物按常规方法进行PCR扩增，获得目的DNA片段；4)通过电泳和胶回收的方法分别纯化由步骤1)获得的线形载体DNA和步骤3)获得的目的DNA片段；5)将经过步骤4)纯化获得的目的DNA片段和线形载体DNA混合，并加入核酸外切酶III和核酸外切酶III反应缓冲液，组成反应体系；6)将步骤5)的反应体系继续反应；7)在步骤6)的反应体系中加入乙二胺四乙酸二钠(EDTA)以终止反应；8)将步骤7)的反应体系置于60°C反应5 IOmin ；9)将步骤8)的反应体系退火；10)从步骤9)的反应体系中取5 10 μ L转化大肠杆菌E. coli感受态细胞；11)将步骤10)的转化菌液涂布含相应抗生素的LB培养基平板，于37°C培养10 15h ；12)从步骤11)的培养平板中挑取单克隆菌落，按常规方法提取质粒进行鉴定，以确定目的DNA片段的成功克隆。在步骤1)中，所述在载体插入位点处用限制性内切酶消化载体，是指载体在相应的限制性内切酶作用下产生5’突出末端或平末端；所述载体可选自pUC系列、pBOB系列、 pcDNA系列、pBKS系列、pCMV系列、pLV系列等基因工程中DNA克隆使用的任何一种载体。在步骤2)中，所述设计合成PCR扩增引物由载体同源序列和目的DNA片段同源序列两部分组成①引物5’端含有约8 20bp左右的拟插入载体的同源序列，该序列在核酸外切酶III的作用下能产生与载体插入位点处序列互补配对的长粘性末端；②引物3’端则是15 40bp待扩增目的DNA片段的引物，用于与目的DNA片段互补配对，扩增目的DNA片段。在步骤5)中，所述目的DNA片段可为10 lOOng，所述线形载体DNA的含量可为10 lOOng，其中线形载体DNA的最佳含量为25ng ；所述目的DNA片段与线形载体DNA之间的分子比例可为(1 4) 1，最佳比例为2 1 ；所述核酸外切酶III的酶活浓度为10 lOOunits，最佳酶活浓度为20units。在步骤6)中，所述反应的条件可为温度为冰浴或4°C，时间为10 MOmin ；最佳反应的条件为4°C反应lh。在步骤7)中，所述EDTA的加入量可为1 μ L，0. 5mol/L，ρΗ8· 0。在步骤9)中，所述退火的温度可为冰浴或4°C，退火的时间可本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种ＤＮＡ克隆方法，其特征在于包括以下步骤：１）在载体插入位点处用限制性内切酶消化载体，获得线形载体ＤＮＡ；２）根据目的ＤＮＡ片段和载体插入位点处序列设计合成ＰＣＲ扩增引物；３）用所合成的ＰＣＲ扩增引物按常规方法进行ＰＣＲ扩增，获得目的ＤＮＡ片段；４）通过电泳和胶回收的方法分别纯化由步骤１）获得的线形载体ＤＮＡ和步骤３）获得的目的ＤＮＡ片段；５）将经过步骤４）纯化获得的目的ＤＮＡ片段和线形载体ＤＮＡ混合，并加入核酸外切酶ＩＩＩ和核酸外切酶ＩＩＩ反应缓冲液，组成反应体系；６）将步骤５）的反应体系继续反应；７）在步骤６）的反应体系中加入乙二胺四乙酸二钠以终止反应；８）将步骤７）的反应体系置于６０℃反应５～１０ｍｉｎ；９）将步骤８）的反应体系退火；１０）从步骤９）的反应体系中取５～１０μＬ转化大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉ感受态细胞；１１）将步骤１０）的转化菌液涂布含相应抗生素的ＬＢ培养基平板，于３７℃培养１０～１５ｈ；１２）从步骤１１）的培养平板中挑取单克隆菌落，按常规方法提取质粒进行鉴定，以确定目的ＤＮＡ片段的成功克隆。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩家淮，梁耀极，蒙丹，陈万泽，吴秀榕，李立胜，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：92